吸光度与比色分析

自然界中许多物质的溶液是有颜色的——高锰酸钾溶液显紫红色，硫酸铜溶液显蓝色，铁离子与硫氰酸钾反应后呈现鲜红色。颜色的深浅往往与物质的浓度直接相关，浓度越高，颜色越深。比色分析正是利用这一规律，通过测量溶液对光的吸收程度来确定物质的含量。

与滴定分析不同，比色分析（光度分析）不需要找到终点，而是在溶液中发生显色反应后，直接测量溶液的“颜色深浅”，从而推算出待测物的浓度。这种方法灵敏度高，特别适合测定微量甚至痕量物质，在食品检测、环境监测和医学检验中广泛应用。

比色分析的核心依据是朗伯-比尔定律：溶液对光的吸收程度（吸光度 $A$ ）与溶液浓度 $c$ 和液层厚度 $b$ 成正比，即 $A = \varepsilon bc$ 。

光与颜色的关系

要理解比色分析，首先需要了解为什么溶液会有颜色，以及“颜色”与“光”之间的关系。

可见光与互补色

白光（如太阳光）是由各种波长的光混合而成的。可见光的波长范围约为 400～760 nm，不同波长的光对应不同的颜色：

当一束白光照射到有色溶液上，溶液会选择性地吸收某一波长的光，而透过（或反射）其余波长的光。人眼看到的颜色，正是被透过的光的颜色——即被吸收光的互补色。

以高锰酸钾溶液为例： $\mathrm{KMnO_4}$ 溶液主要吸收 500～560 nm 的绿色光，透过红色和紫色光，因此呈现出紫红色。硫酸铜溶液主要吸收橙黄色光（580～620 nm），透过蓝色光，所以溶液看起来是蓝色的。

记忆互补色有一个实用技巧：在上表中，颜色与其互补色在表格两列中互相对应。溶液显示什么颜色，就说明它主要吸收了哪种颜色的光。

为什么颜色深浅与浓度有关

同一种有色物质，浓度越大，溶液中吸光的粒子数越多，对光的吸收越强，溶液颜色越深。这是目视比色法（用肉眼比较颜色深浅）和仪器光度法共同的定量依据。

朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光（即单一波长的光）通过均匀的有色溶液时，光的强度会因被吸收而减弱。描述这一关系的定量规律，就是朗伯-比尔定律（Lambert-Beer Law）。

透射率与吸光度

设入射光强度为 $I_0$ ，通过溶液后透射光强度为 $I_t$ ，则透射率 $T$ 定义为：

T = \frac{I_t}{I_0}

$T$ 的取值范围为 0～1（或写成百分数 0～100%）。 $T$ 越大，透射光越强，溶液对光的吸收越弱，颜色越浅； $T$ 越小，溶液对光的吸收越强，颜色越深。

然而，实验发现透射率 $T$ 与浓度 $c$ 之间是指数关系，不便于直接用于定量计算。因此引入吸光度 $A$ （Absorbance）：

A = -\lg T = \lg \frac{I_0}{I_t}

吸光度 $A$ 与浓度呈线性关系，使用起来更方便。

可以看出，溶液完全不吸光时 $A = 0$ ，透射率越低（吸收越强）， $A$ 值越大。实际测量中， $A$ 的最佳范围一般在 0.1～0.8 之间。

朗伯-比尔定律的数学表达

综合朗伯定律（吸光度与液层厚度成正比）和比尔定律（吸光度与浓度成正比），得到完整的朗伯-比尔定律：

A = \varepsilon b c

其中：

$A$ ——吸光度，无量纲
$\varepsilon$ ——摩尔吸光系数，单位 $\mathrm{L \cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1}}$
$b$ ——液层厚度（光程长度），单位

朗伯-比尔定律成立的前提是：使用单色光（单一波长），溶液均匀透明，溶液浓度不能太高（一般 $c < 0.01\ \mathrm{mol/L}$ ）。浓度过高时，溶质粒子间相互作用增大，会导致 $A$ 与 $c$ 的线性关系发生偏差。

例题一　用某波长的光测定铁离子溶液，液层厚度 $b = 2.00\ \mathrm{cm}$ ，测得吸光度 $A = 0.480$ ，已知该条件下摩尔吸光系数 $\varepsilon = 1.20 \times 10^4\ \mathrm{L \cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1}}$ 。求溶液中铁离子的浓度。

解析　由朗伯-比尔定律 $A = \varepsilon bc$ ，变形得：

c = \frac{A}{\varepsilon b} = \frac{0.480}{1.20 \times 10^4\ \mathrm{L \cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1}} \times 2.00\ \mathrm{cm}}

c = 2.00 \times 10^{-5}\ \mathrm{mol/L}

摩尔吸光系数

摩尔吸光系数 $\varepsilon$ 是朗伯-比尔定律中反映物质吸光能力的特征常数，其物理意义是：当浓度为 $1\ \mathrm{mol/L}$ 、液层厚度为 $1\ \mathrm{cm}$ 时，溶液的吸光度值。

$\varepsilon$ 的大小取决于物质本身的性质（化学结构、电子跃迁类型）和测量所用的波长，而与浓度和液层厚度无关。

$\varepsilon$ 越大，表示该物质对该波长的光吸收越强，检测灵敏度越高，在更低的浓度下也能产生可以测量的吸光度。通常认为 $\varepsilon > 10^4$ 的显色反应灵敏度较高，适合痕量分析。

分光光度计的基本结构

要精确测量溶液的吸光度，需要用到分光光度计。了解它的基本构成，有助于理解实验操作的意义和注意事项。

分光光度计由以下五个核心部分构成：

\text{光源} \longrightarrow \text{单色器} \longrightarrow \text{吸收池（比色皿）} \longrightarrow \text{检测器} \longrightarrow \text{显示读数}

各部分的功能如下：

比色皿的使用注意事项

比色皿（吸收池）是放置溶液的容器，通常为石英或玻璃材质，光程长度为标准的 1.000 cm。使用时需注意：

透明的光学面不能用手触摸，只能持握毛玻璃面；测量前需用待测液润洗比色皿 2～3 次，确保溶液浓度不被稀释；比色皿外壁的液体要用擦镜纸（而非普通纸巾）轻轻拭干；测量参比溶液和样品溶液的比色皿必须配对使用，以消除比色皿本身带来的误差。

测量条件的选择

正确选择测量条件，是获得准确结果的关键步骤，主要涉及测量波长的选择和参比溶液的选择。

测量波长的选择

测量波长应选在待测物质吸收最强的波长处，即最大吸收波长 $\lambda_{\max}$ 。在 $\lambda_{\max}$ 处测量有以下优点：

吸光度最大，灵敏度最高； $A$ 对波长的变化最不敏感（处于吸收峰顶部的平坦区域），即使波长有细小偏差，对结果影响也小，重现性好。

确定 $\lambda_{\max}$ 的方法是绘制吸收曲线（吸收光谱）：在固定浓度下，依次改变测量波长，记录各波长下的吸光度，以波长为横轴、吸光度为纵轴作图，吸光度最大处对应的波长即为 $\lambda_{\max}$ 。

例题二　对铬的显色溶液进行吸收曲线测定，部分数据如下。判断最佳测量波长，并说明理由。

波长（nm）	460	500	520	540	560	580	620
吸光度 $A$	0.120	0.310	0.465	0.520	0.498	0.370	0.180

解析　在 540 nm 处吸光度达到最大值 0.520，说明该波长是溶液的最大吸收波长 $\lambda_{\max} = 540\ \mathrm{nm}$ 。选用 540 nm 作为测量波长，灵敏度最高，且处于吸收峰平坦区，测量结果稳定可靠。

参比溶液的选择

分光光度计测量的是溶液对光的吸收，但比色皿、溶剂本身也会吸收或散射少量光。为消除这些因素的干扰，测量前需先用参比溶液将仪器调零（即将参比溶液的吸光度设定为 0），再测定样品溶液的吸光度。

参比溶液的作用是抵消溶剂、显色剂、比色皿等的“背景吸收”，确保测量到的吸光度只反映待测物的贡献。正确选择参比溶液是减小系统误差的重要操作步骤。

标准曲线法

标准曲线法（又称工作曲线法）是分光光度分析中最常用的定量方法，准确性高，适用范围广。

基本步骤

第一步：配制系列标准溶液　准备一组已知浓度的标准溶液，浓度梯度均匀分布，通常 5～7 个浓度点，浓度范围涵盖待测样品的预期浓度。

第二步：显色与测量　对每个标准溶液按相同操作步骤加入显色剂，在 $\lambda_{\max}$ 处测量各标准溶液的吸光度 $A$ 。

第三步：绘制标准曲线　以浓度 $c$ 为横轴、吸光度 $A$ 为纵轴作图，正常情况下各点应在一条过原点的直线附近，这条直线就是标准曲线（工作曲线）。

第四步：测定未知样品　对待测样品进行相同的显色处理，测量其吸光度 $A_x$ ，从标准曲线上找到对应的浓度值，即为样品浓度 $c_x$ 。

例题三　用邻菲罗啉法测定水样中铁的含量，配制了 6 个铁标准溶液，在 $\lambda = 510\ \mathrm{nm}$ 处测得吸光度如下表所示。

铁浓度 $c$ （ $\mathrm{\mu g/mL}$ ）	0	0.20	0.40	0.60	0.80	1.00
吸光度 $A$	0.000	0.097	0.196	0.294	0.392	0.490

对水样进行相同处理后，测得吸光度 $A_x = 0.245$ 。求水样中铁的浓度（ $\mathrm{\mu g/mL}$ ）。

解析　由标准数据可知， $A$ 与 $c$ 成正比，斜率为：

k = \frac{0.490 - 0.000}{1.00 - 0} = 0.490\ \mathrm{mL/\mu g}

标准曲线方程为：

A = 0.490 \times c

将 $A_x = 0.245$ 代入：

c_x = \frac{A_x}{0.490} = \frac{0.245}{0.490} = 0.500\ \mathrm{\mu g/mL}

水样中铁的浓度为 $0.500\ \mathrm{\mu g/mL}$ 。

标准曲线法的准确度优于简单的标准对比法，因为它利用了多点数据，减少了单次测量误差的影响。绘制标准曲线时，各点应大致在直线上，若某一点明显偏离，需检查是否有操作失误。

比色分析的计算应用

分光光度分析的计算通常分为两类：一类是已知标准曲线方程（或斜率），直接代入求浓度；另一类是利用标准对比法，通过标准溶液和待测溶液的吸光度之比来计算浓度。

标准对比法

当只有一个标准溶液时，可用标准对比法。设标准溶液浓度为 $c_s$ ，吸光度为 $A_s$ ；待测溶液吸光度为 $A_x$ ，浓度为 $c_x$ 。由朗伯-比尔定律，在相同和下：

\frac{A_x}{A_s} = \frac{\varepsilon b c_x}{\varepsilon b c_s} = \frac{c_x}{c_s}

因此：

c_x = c_s \times \frac{A_x}{A_s}

例题四　用标准对比法测定某溶液中 $\mathrm{Cr}$ 的含量。配制浓度 $c_s = 0.800\ \mathrm{\mu g/mL}$ 的铬标准溶液，在 540 nm 处测得 $A_s = 0.420$ 。对待测样品进行相同处理后测得。求样品中铬的浓度。

解析　由标准对比法公式：

c_x = c_s \times \frac{A_x}{A_s} = 0.800\ \mathrm{\mu g/mL} \times \frac{0.315}{0.420}

c_x = 0.800 \times 0.750 = 0.600\ \mathrm{\mu g/mL}

标准对比法使用简便，但要求标准溶液的浓度与待测溶液浓度接近（一般要求在线性范围内，且偏差不超过 10%），否则因曲线非线性带来的误差较大。

吸光度加和性

当溶液中含有多种吸光物质，且它们之间互不反应、互不干扰时，溶液在某一波长下的总吸光度等于各组分吸光度之和：

A_{\text{总}} = A_1 + A_2 + \cdots = \varepsilon_1 b c_1 + \varepsilon_2 b c_2 + \cdots

这一性质称为吸光度的加和性，是多组分同时测定的理论依据。

练习题

一、选择题

1. 高锰酸钾溶液显紫红色，这是因为 $\mathrm{KMnO_4}$ 溶液（　　）。

A. 吸收了紫红色光，透过了绿色光

B. 吸收了绿色光，透过了紫红色光

C. 不吸收任何光，全部反射紫红色光

D. 吸收了所有可见光，只发出紫红色荧光

答案：B

考查知识点：溶液颜色与互补色的关系。溶液呈现的颜色是它透过（未被吸收）的光的颜色。高锰酸钾溶液显紫红色，说明它主要吸收了紫红色的互补色——绿色光（500～560 nm），透过了紫红色光。A 选项颠倒了吸收与透射的关系。

2. 下列关于朗伯-比尔定律 $A = \varepsilon bc$ 的说法，正确的是（　　）。

A. $\varepsilon$ 越大，说明该物质浓度越高

B. 在相同条件下，增大液层厚度 $b$ ，吸光度 $A$ 减小

C. 只有使用单色光时，朗伯-比尔定律才成立

D. 吸光度 $A$ 与透射率 $T$ 的关系是 $A = T$

答案：C

考查知识点：朗伯-比尔定律的适用条件与各量的关系。 $\varepsilon$ 是物质的固有吸光能力，与浓度无关（A 错）； $b$ 增大，吸光度 $A$ 增大，而非减小（B 错）； $A = -\lg T$ ，而不是 $A = T$ （D 错）；朗伯-比尔定律严格要求使用单色光，否则会产生偏差（C 正确）。

3. 用分光光度法测定某有色溶液时，应选择的测量波长是（　　）。

A. 与溶液颜色相同的光的波长

B. 与溶液颜色互补的光的波长（即最大吸收波长 $\lambda_{\max}$ ）

C. 波长最短的紫外光

D. 任意波长，对结果无影响

答案：B

考查知识点：测量波长的选择原则。在最大吸收波长 $\lambda_{\max}$ 处测量，灵敏度最高，且处于吸收曲线的峰顶平坦区，对波长的微小波动不敏感，结果重现性好。最大吸收波长对应的是溶液吸收最强的光，即其互补色的波长（B 正确）。

4. 在分光光度分析中，使用参比溶液调零的主要目的是（　　）。

A. 提高待测溶液的颜色深度

B. 消除溶剂、比色皿和显色剂等的背景吸收，使测量结果只反映待测物的吸光度

C. 防止溶液浓度过高超出线性范围

D. 使标准曲线一定过原点

答案：B

考查知识点：参比溶液的作用。比色皿本身、溶剂和显色剂都可能对入射光有一定吸收（背景吸收）。用参比溶液调零，相当于把这些背景因素“扣除”，确保最终读取的吸光度值是待测物质自身吸收的贡献。这是消除系统误差的重要操作（B 正确）。

二、计算题

5. 用邻菲罗啉分光光度法测定某废水样品中铁的含量。取废水样品 $50.00\ \mathrm{mL}$ ，经显色处理后转入 $100.0\ \mathrm{mL}$ 容量瓶并定容。在 $\lambda = 510\ \mathrm{nm}$ 、 $b = 1.00\ \mathrm{cm}$ 条件下测得吸光度。已知邻菲罗啉铁配合物的摩尔吸光系数，铁的摩尔质量。求废水样品中铁的质量浓度（）。

答案：废水中铁的质量浓度为 $\approx 3.67\ \mathrm{mg/L}$

考查知识点：由朗伯-比尔定律计算浓度，再换算为原样品的质量浓度（注意稀释倍数）。

第一步：由朗伯-比尔定律计算显色溶液中铁的物质的量浓度

取 50.00 mL 废水定容至 100.0 mL，稀释倍数为 2，显色溶液的浓度是原废水的一半。

c(\text{显色液}) = \frac{A}{\varepsilon b} = \frac{0.362}{1.10 \times 10^4\ \mathrm{L \cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1}} \times 1.00\ \mathrm{cm}} = 3.29 \times 10^{-5}\ \mathrm{mol/L}

6. 用标准曲线法测定某饮料中铬的含量。配制铬标准系列溶液并测定吸光度，数据如下。另取饮料样品 $25.00\ \mathrm{mL}$ ，经处理显色后在相同条件下测得吸光度 $A_x = 0.336$ 。

铬标准溶液浓度（ $\mathrm{\mu g/mL}$ ）	0	0.100	0.200	0.400	0.600	0.800
吸光度 $A$	0.000	0.053	0.105	0.210	0.315	0.420

（1）写出标准曲线方程；（2）计算饮料样品中铬的浓度（ $\mathrm{\mu g/mL}$ ）；（3）计算 25.00 mL 饮料中铬的总质量（ $\mathrm{\mu g}$ ）。

答案：（1） $A = 0.525c$ ；（2） $c_x = 0.640\ \mathrm{\mu g/mL}$ ；（3） $m = 16.0\ \mathrm{\mu g}$

A = 0.362

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