微生物学概论与研究方法

微生物学是研究各种微小生物体的科学，这些生物体包括细菌、真菌、病毒、放线菌、支原体、立克次体、螺旋体等，它们通常直径在几微米甚至更小，肉眼无法直接观察到，需借助显微镜等专门的仪器才能看清。微生物无处不在，分布极广，从空气、水体、土壤到人体、动植物体内外都有它们的身影。人类日常生活和自然界的生态系统都离不开微生物的参与。例如，酿造醋和酱油要用到醋酸菌和乳酸菌；面包和酒的发酵离不开酵母菌；环境中的分解者真菌和细菌帮助有机物降解循环；某些细菌还能和植物根系共生，固氮肥田。

但与此同时，微生物中也有致病者，如引起感冒的病毒、导致食物中毒的大肠杆菌等。微生物不仅在人类疾病、食品、农业和环境中发挥着重要作用，还在生物技术、能源开发、药物研制等高新技术产业领域具有广阔应用前景。因此，微生物学是一门基础性、交叉性很强的学科，对人类社会和自然界均有深远影响。

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微生物学的研究范畴与发展历程

微生物学的诞生与早期发展

微生物学的历史可以追溯到17世纪。1676年，荷兰布商列文虎克用自己制作的简单显微镜首次观察到了微生物。他在雨水、池塘水和自己的牙垢中发现了许多“微小的动物”，并详细记录了它们的形态和运动方式。这一发现为微生物学的诞生奠定了基础。

真正将微生物学建立为一门独立科学的是法国化学家巴斯德和德国医生科赫。巴斯德在19世纪中叶通过一系列巧妙的实验，证明了发酵是由微生物引起的生命活动，而不是化学反应。他设计的鹅颈瓶实验彻底推翻了“自然发生学说”，证明了生命只能来自生命。这个实验的原理很简单：将肉汤装在一个颈部呈S形弯曲的烧瓶中煮沸消毒，空气可以进入，但空气中的微生物会被阻挡在弯曲的颈部。结果肉汤长期保持无菌状态，而将瓶颈打断后，肉汤很快就腐败了。

科赫则在医学微生物学领域做出了卓越贡献。他建立了确定病原微生物的“科赫法则”，即必须满足四个条件才能证明某种微生物是某种疾病的病原体。科赫还发明了固体培养基技术，使得分离和培养纯种微生物成为可能。他成功分离出了炭疽杆菌和结核杆菌，为传染病的防治开辟了新道路。

中国微生物学的发展轨迹

中国的微生物学研究始于20世纪初。1906年，伍连德博士成功控制了东北地区的鼠疫大流行，成为中国现代微生物学应用的重要里程碑。新中国成立后，微生物学研究得到了快速发展。中国科学家在抗生素研发、农业微生物、环境微生物等领域取得了显著成就。

20世纪80年代以来，随着分子生物学技术的发展，中国微生物学研究进入了新阶段。中国科学家在极端环境微生物、微生物基因组学、合成生物学等前沿领域开展了深入研究。例如，中国科学家在青藏高原发现了大量耐寒微生物，在深海热泉发现了耐高温微生物，这些研究为开发新型酶制剂和生物技术产品提供了宝贵资源。

下表展示了微生物学发展的重要时期及其标志性成就：

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微生物的定义、特点与分类

什么是微生物

微生物是一大类个体微小、结构简单的生物的总称。一般来说，需要借助显微镜才能观察到的生物都属于微生物范畴。但这个定义并不绝对，因为有些微生物如某些霉菌的菌落，可以用肉眼看到；而有些较大的微生物如蛔虫，虽然可以用肉眼看到，但不属于微生物。因此，微生物的定义更多地是基于其生物学特征而非单纯的大小。

从细胞结构来看，微生物可以是单细胞生物，如细菌和酵母菌；也可以是多细胞生物，如某些霉菌；还可以是无细胞结构的生物，如病毒。从进化地位来看，微生物包括原核生物、真核生物和非细胞生物，跨越了生命之树的多个分支。

微生物的基本特点

微生物具有一些共同的特点，这些特点使它们能够在各种环境中生存和繁衍。首先是体积微小、比表面积大。微生物的直径通常在几微米到几十微米之间，有些细菌甚至只有零点几微米。巨大的比表面积使微生物能够高效地与环境进行物质交换，快速吸收营养物质和排出代谢废物。

其次是生长繁殖速度快。在适宜条件下，许多细菌的世代时间只有20到30分钟。以大肠杆菌为例，如果每20分钟分裂一次，理论上一个细胞在24小时内可以产生约72代后代，细胞数量将达到天文数字。当然，实际情况中由于营养限制、代谢产物积累等因素，微生物不可能无限增殖。

第三是分布广泛、种类繁多。从南极冰川到深海热泉，从高山之巅到地壳深处，几乎所有环境都有微生物的存在。有些微生物能在极端环境中生存，如耐高温的古菌可以在100℃以上的环境中生长，耐盐菌可以在饱和盐溶液中生存，耐酸菌可以在pH值为1的强酸环境中繁殖。

第四是易发生变异。微生物的基因组相对简单，突变率较高，在环境压力下容易产生适应性变异。这一特点使微生物成为研究进化和遗传的理想材料，同时也带来了病原微生物耐药性等问题。

微生物的分类系统

微生物的分类经历了从形态分类到生理生化分类，再到分子系统分类的发展过程。现代微生物分类主要基于系统发育关系，将微生物分为三个域：细菌域、古菌域和真核生物域。

细菌域包括大多数常见的细菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸菌等。这些微生物都是原核生物，具有细胞壁但无核膜。细菌的形态多样，有球状、杆状、螺旋状等，它们在自然界的物质循环和能量转化中发挥着重要作用。

古菌域的成员也是原核生物，但在基因和代谢特征上与细菌有显著差异。许多古菌生活在极端环境中，如高温、高盐、强酸等环境。产甲烷古菌是古菌的一个重要类群，它们能够在无氧条件下产生甲烷，是天然气的重要来源。

真核微生物包括原生动物、真菌和微型藻类。酵母菌是单细胞真菌，在发酵工业中应用广泛。霉菌是多细胞真菌，如青霉菌可以产生青霉素。原生动物如草履虫、变形虫等，是重要的水生微生物。

病毒是一类特殊的微生物，它们没有细胞结构，只能在活细胞内复制。病毒由核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成，有些病毒还具有脂质包膜。病毒种类繁多，既有感染细菌的噬菌体，也有感染动植物的各种病毒。

下表总结了主要微生物类群的基本特征：

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微生物学研究的基本技术与方法

显微镜观察技术

显微镜是微生物学研究最基本的工具。根据成像原理的不同，显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜利用可见光作为光源，通过透镜系统放大物体。普通光学显微镜的放大倍数可达1000到2000倍，分辨率约为0.2微米，适合观察细菌、酵母菌等较大的微生物。

在微生物观察中，常用的光学显微镜技术包括明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜。明视野显微镜是最常用的类型，适合观察染色后的微生物标本。暗视野显微镜利用散射光成像，适合观察活的、未染色的微生物，如螺旋体。相差显微镜可以将相位差转换为振幅差，使透明的微生物细胞产生明暗对比，特别适合观察活细胞的内部结构。

荧光显微镜是现代微生物学研究的重要工具。它利用某些物质受紫外光或蓝光照射后能发出荧光的特性进行观察。通过使用特异性荧光染料或荧光标记的抗体，可以在复杂样品中特异性识别和定位目标微生物或其特定结构。例如，DAPI染料能与DNA结合并发出蓝色荧光，常用于细胞核的定位和计数。

电子显微镜利用电子束代替可见光，放大倍数可达数十万倍，分辨率可达0.2纳米，能够观察到病毒和细胞的超微结构。扫描电子显微镜（SEM）可以观察微生物的表面形态，呈现立体效果。透射电子显微镜（TEM）则可以观察微生物的内部结构，如细胞膜、细胞器等。

微生物染色技术

由于大多数微生物是透明或半透明的，直接在显微镜下观察往往对比度不够。染色技术通过使用特定的染料使微生物着色，增强观察效果，同时也能提供微生物特征的信息。

简单染色是最基本的染色方法，使用单一染料如美蓝、结晶紫等，可以显示微生物的形态和大小。复合染色使用两种或多种染料，能够区分不同的微生物结构或类群。革兰氏染色是最重要的复合染色方法，由丹麦医生革兰于1884年发明。这个方法能将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，这种分类不仅反映了细胞壁结构的差异，也与细菌的生理特性和药物敏感性密切相关。

革兰氏染色的基本步骤包括：首先用结晶紫初染，所有细菌都被染成紫色；然后用碘液媒染，形成不溶于水的结晶紫-碘复合物；接着用酒精脱色，革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚能保持紫色，而革兰氏阴性菌被脱色；最后用沙黄复染，革兰氏阴性菌被染成红色。中国传统发酵食品如酱油、醋中的乳酸菌多为革兰氏阳性菌。

芽孢染色是另一种重要的染色方法，用于观察某些细菌在不良环境下形成的芽孢结构。芽孢具有极强的抗性，能够耐受高温、干燥、化学消毒剂等极端条件。荚膜染色可以显示某些细菌表面的荚膜，荚膜是细菌的保护结构，能够帮助细菌逃避宿主免疫系统的攻击。鞭毛染色则可以显示细菌的鞭毛，鞭毛是细菌的运动器官。

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纯培养技术与无菌操作

培养基的类型与配制

培养基是供微生物生长繁殖的人工配制的营养基质。一个完整的培养基必须包含微生物生长所需的水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分，同时要具有适宜的pH值和渗透压。

根据物理性状，培养基可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。液体培养基主要用于微生物的大量培养，如发酵工业中的大规模生产。固体培养基中加入了琼脂等凝固剂，主要用于微生物的分离、计数和保藏。琼脂是从海藻中提取的多糖，在温度高于45℃时呈液态，低于40℃时凝固成胶状，这一特性使它成为制备固体培养基的理想材料。半固体培养基的琼脂含量较低，呈半流动状态，常用于观察细菌的运动性。

根据营养成分，培养基可分为基础培养基、丰富培养基、选择培养基和鉴别培养基。基础培养基含有微生物生长的基本营养成分，如牛肉膏蛋白胨培养基。丰富培养基在基础培养基中添加了血液、血清等营养丰富的物质，用于培养营养要求较高的微生物。选择培养基中添加了某些化学物质，抑制某些微生物的生长而允许目标微生物生长，用于从混合菌群中分离特定微生物。鉴别培养基中加入了指示剂或特殊底物，不同微生物在培养基上呈现不同的菌落特征，便于鉴别。

以分离大肠杆菌为例，可以使用伊红美蓝（EMB）培养基。这是一种选择鉴别培养基，其中的染料对革兰氏阳性菌有抑制作用，而大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，使菌落呈现深紫色并带有金属光泽。这样，即使在含有多种细菌的样品中，也能快速识别出大肠杆菌的菌落。

微生物的分离与纯化

从自然界获得的微生物样品通常包含多种微生物，需要通过分离技术获得单一种类的微生物，即纯培养物。常用的分离方法包括平板划线法、稀释涂布法和单细胞分离法。

平板划线法是最常用的分离方法，操作简便且成功率高。其原理是通过反复划线，使微生物在平板表面逐渐稀释分散，最终获得单个细胞形成的菌落。具体操作时，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后蘸取少量菌液，在平板的一个区域内往复划线，然后灼烧接种环，从第一区域边缘蘸取少量菌体，在第二区域划线，依次类推，通常划三到五个区域。经过培养后，最后的区域会出现分散的单个菌落。

稀释涂布法适用于菌液浓度较高的样品。将菌液用无菌水进行系列稀释，取适当稀释度的菌液涂布在平板表面，经培养后会出现分散的菌落。这个方法不仅可以分离微生物，还可以通过计算菌落数来测定原菌液的浓度。

单细胞分离法是最彻底的分离方法，在显微镜下直接挑取单个细胞进行培养。这个方法技术要求高，但可以确保获得绝对纯的培养物，常用于重要的科研工作。

获得单个菌落后，还需要进行纯度检查。可以通过显微镜观察菌体形态的一致性，通过染色检查细胞结构的一致性，或者在不同的培养基上培养观察菌落特征的一致性。只有经过严格的纯度检查，确认只含有一种微生物，才能称为纯培养物。

无菌操作技术

无菌操作是微生物学实验的基本要求，目的是防止实验过程中外来微生物的污染。无菌操作包括灭菌、消毒和防止污染三个方面。

灭菌是指杀死或去除物体上所有微生物，包括细菌的芽孢。高压蒸汽灭菌是最常用的灭菌方法，在121℃、压力为103千帕的条件下，维持15到30分钟，可以有效杀死包括芽孢在内的所有微生物。这个方法适用于培养基、玻璃器皿、金属器械等耐高温高压的物品。对于不耐高温的物质，可以采用过滤除菌法，使用孔径为0.22微米的滤膜过滤，可以除去细菌和真菌，但不能除去病毒。

干热灭菌适用于玻璃器皿、金属器械等物品，在160到170℃的烘箱中加热1到2小时。紫外线照射可用于空气和物体表面的消毒，但穿透力弱，只能作为辅助手段。火焰灭菌用于金属器械如接种环、镊子等的快速灭菌，将器械在火焰上灼烧至通红即可。

在实际操作中，需要建立一个相对无菌的工作区域。超净工作台通过高效空气过滤器提供无菌空气，形成一个洁净的操作环境。在接种操作时，要在酒精灯火焰附近进行，因为火焰周围的上升气流可以防止空气中的微生物落入培养物中。所有器械在使用前后都要进行灭菌处理，避免交叉污染。

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微生物的培养与生长测定

微生物的生长曲线

当将少量微生物接种到新鲜的液体培养基中，在适宜的条件下培养，微生物的生长会经历四个典型的时期：延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。这四个时期构成了微生物的生长曲线。

延迟期也称适应期，是微生物接种到新环境后的调整阶段。此时微生物并不立即分裂，而是合成适应新环境所需的酶类和其他物质，修复受损的细胞结构，调整代谢状态。延迟期的长短取决于接种物的生理状态、培养条件的差异等因素。如果将处于对数生长期的菌种接种到成分相同的新鲜培养基中，延迟期会很短；反之，如果接种物来自衰老培养物，或培养条件变化较大，延迟期就会较长。

对数生长期是微生物生长最旺盛的时期，细胞以恒定的最大速率分裂增殖，细胞数量以指数方式增加。此时微生物的代谢活动最强，对环境因素最敏感，也最适合进行生理生化研究。工业生产中常在这一时期收获菌体或代谢产物。中国的传统发酵工艺如制醋、制酱，就是利用微生物在对数生长期代谢旺盛的特点。

稳定期时，由于营养物质的消耗和代谢产物的积累，微生物的生长速率下降，新生细胞数与死亡细胞数基本相等，活菌总数维持恒定。一些微生物在稳定期会产生次级代谢产物，如抗生素、色素等。青霉素、链霉素等抗生素的工业生产就是利用这一特性，在稳定期收获产物。

衰亡期时，营养耗尽，有毒代谢产物大量积累，细胞死亡速率超过新生速率，活菌数快速下降。有些细菌在此时会形成芽孢以度过不良环境。理解微生物的生长规律对于发酵工业、食品保藏、疾病防治等都有重要意义。

微生物计数方法

准确测定微生物的数量对于科研和生产都非常重要。微生物计数方法主要分为直接计数法和间接计数法两大类。

直接计数法包括显微镜直接计数和平板菌落计数。显微镜直接计数使用专门的计数室（如血细胞计数板），在显微镜下直接计数一定体积内的细胞数，然后换算成每毫升菌液中的细胞总数。这个方法快速简便，但不能区分死细胞和活细胞，且对于浓度较低的样品不够准确。

平板菌落计数法是最常用的活菌计数方法。其原理是将适当稀释的菌液涂布在固体培养基表面，每个活的细菌细胞都会生长繁殖形成一个可见的菌落，通过计数菌落数即可推算原菌液中的活菌数。这个方法只能计数活菌，结果可靠，但操作较复杂，培养时间较长，不同微生物需要不同的培养基和培养条件。

间接计数法通过测定与微生物数量相关的某些理化指标来推算微生物的数量。比重法通过测定培养液的浑浊度来估算微生物数量，浑浊度越高说明微生物越多。这个方法快速简便，适合连续监测微生物的生长过程，但精度较低，且受培养基成分的干扰。干重法是测定一定体积培养液中微生物的干燥重量，适用于霉菌等丝状微生物的测定。生理指标法通过测定微生物的代谢活动如耗氧量、产酸量等来估算微生物数量。

在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的计数方法。例如，在发酵工业中监测发酵过程，常用比重法快速估算菌体浓度；在食品卫生检验中需要准确测定食品中的活菌数，则应采用平板菌落计数法；在研究微生物生长动力学时，可能需要同时使用多种方法以获得全面的信息。

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本节练习

1. 下列关于微生物特点的描述，不正确的是：

A. 微生物体积微小，比表面积大，物质代谢效率高

B. 微生物生长繁殖速度快，适应环境能力强

C. 所有微生物都必须用显微镜才能观察到

D. 微生物分布广泛，在极端环境中也能生存

2. 革兰氏染色法中，革兰氏阳性菌呈现紫色的原因是：

A. 革兰氏阳性菌细胞壁较厚，能保留结晶紫-碘复合物

B. 革兰氏阳性菌细胞壁较薄，容易吸收结晶紫染料

C. 革兰氏阳性菌细胞壁含有脂多糖，与染料结合牢固

D. 革兰氏阳性菌细胞膜具有特殊结构，能储存染料

3. 在微生物生长曲线中，最适合进行生理生化研究的时期是：

A. 延迟期

B. 对数生长期

C. 稳定期

D. 衰亡期

4. 下列灭菌方法中，最彻底且能杀死细菌芽孢的是：

A. 紫外线照射

B. 化学消毒剂处理

C. 高压蒸汽灭菌

D. 巴氏消毒法

5. 在微生物分离过程中，使用EMB（伊红美蓝）培养基属于：

A. 基础培养基

B. 丰富培养基

C. 选择鉴别培养基

D. 合成培养基

6. 简述巴斯德鹅颈瓶实验的设计思路及其对微生物学发展的意义。

7. 比较平板划线法和稀释涂布法在微生物分离中的优缺点及适用情况。