细胞培养基础
细胞培养技术是现代生物技术研究中不可或缺的一项基本技能。在实验室中培养细胞，我们能够在体外模拟生命活动的基本过程，为药物开发、疾病研究、组织工程等领域提供重要的研究平台。掌握细胞培养的基础知识，不仅需要了解细胞的基本特性，更需要建立起严格的无菌观念和规范的操作习惯。
原核细胞与真核细胞的本质差异
在开始细胞培养之前，我们首先需要认识两类完全不同的细胞类型。生物界的细胞按照细胞核结构的有无，可以分为原核细胞和真核细胞。这种分类不仅仅是形态学上的差异，更反映了生命演化历程中的重大分水岭。
原核细胞是地球上最早出现的生命形式。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌都属于原核生物。这类细胞的遗传物质直接分散在细胞质中，没有被核膜包裹起来，形成一个称为"拟核"的区域。原核细胞的结构相对简单，但这并不意味着它们的生命活动简单。相反，原核细胞以其高效的代谢速率和快速的繁殖能力，在自然界中占据着重要的生态位置。在实验室中，大肠杆菌可以在理想条件下每20分钟分裂一次，这种快速增殖的特性使其成为基因工程的理想宿主。
真核细胞的出现标志着生命复杂性的巨大飞跃。动物、植物、真菌等生物都由真核细胞构成。这类细胞拥有被核膜包裹的细胞核，遗传物质被整齐地组织在染色体上。更重要的是，真核细胞内部划分出多个具有特定功能的细胞器，如同一座城市中的不同功能区域。线粒体负责能量生产，内质网负责蛋白质加工，高尔基体负责物质运输和分泌。这种精细的内部分工使得真核细胞能够完成更加复杂的生命活动。
从上图可以看出，原核细胞与真核细胞在大小上存在显著差异。一个典型的大肠杆菌细胞直径约为2微米，而人的成纤维细胞直径可达20微米，是大肠杆菌的10倍。这种大小差异背后反映的是细胞内部结构复杂性的巨大差距。真核细胞需要更大的空间来容纳各种细胞器和复杂的细胞骨架系统。
两类细胞在培养要求上也截然不同。原核细胞培养相对简单，只需要提供基本的碳源、氮源和必需的无机盐，在37℃恒温培养箱中震荡培养即可。而真核细胞的培养则复杂得多，它们对培养环境有着苛刻的要求。温度需要精确控制在37℃，二氧化碳浓度需要维持在5%以保持培养基的pH值稳定，培养基中还需要添加多种生长因子、维生素和血清成分。更重要的是，大多数动物细胞需要贴壁生长，这意味着培养皿表面的材质和处理方式都会影响细胞的生长状态。
在实验室中选择培养原核细胞还是真核细胞，需要根据研究目的来决定。如果研究重点是基因表达或蛋白质生产，大肠杆菌等原核系统因其快速生长和易于操作而成为首选。但如果研究涉及蛋白质的翻译后修饰、细胞信号转导或药物筛选，则必须使用真核细胞培养系统。
细胞生长的动态过程
细胞培养不是简单地将细胞放入培养基中等待它们生长。理解细胞生长的动态规律，对于优化培养条件、选择合适的实验时机至关重要。当我们将一定数量的细胞接种到新鲜培养基中时，细胞的生长会经历四个典型的阶段，这个过程被称为细胞生长曲线。
第一阶段是延滞期，也称为适应期。刚刚接种的细胞需要时间来适应新的培养环境。此时细胞并非不活动，相反，它们正在积极合成各种酶和蛋白质，调整自己的代谢状态。就像一个人搬到新环境需要适应期一样，细胞也需要这段时间来“熟悉”新的培养条件。延滞期的长短取决于多个因素，包括接种细胞的生理状态、培养基的成分、环境条件的差异等。如果接种的细胞来自对数生长期，且新旧培养环境相似，延滞期会相对较短；反之，如果细胞处于生长后期或培养条件变化较大，延滞期就会延长。
第二阶段是对数生长期，这是细胞生长最活跃的时期。此时营养物质充足，代谢废物尚未积累到有害水平，细胞以恒定的速率进行分裂。在这个阶段，细胞数量随时间呈指数增长，如果在半对数坐标系中绘制生长曲线，会呈现出一条直线。对数生长期的细胞代谢最旺盛，生理状态最均一，是进行大多数实验的最佳时机。在这个阶段收获细胞用于分子生物学实验，能够获得最一致的实验结果。
第三阶段是稳定期。随着培养时间的延长，营养物质逐渐消耗，代谢废物不断积累，细胞生长速率开始下降。当新生细胞数与死亡细胞数达到动态平衡时，总细胞数保持相对稳定，这就进入了稳定期。此时细胞的生理状态发生显著改变，许多细胞停止分裂，进入静止状态。有趣的是，某些次级代谢产物的合成往往在稳定期达到高峰。在工业微生物发酵中，许多抗生素和生物活性物质都是在稳定期大量产生的。
第四阶段是衰亡期。营养物质的持续消耗和代谢废物的大量积累，最终导致培养环境恶化到无法维持细胞存活的程度。细胞开始大规模死亡，活细胞数量急剧下降。死亡的细胞裂解释放出细胞内容物，进一步恶化培养环境，形成恶性循环。在这个阶段，培养基往往会出现浑浊、颜色改变等现象，这是细胞死亡和分解的标志。
细胞的繁殖方式决定了它们的生长特性。原核细胞通过二分裂方式繁殖，这是一个相对简单的过程。细胞首先复制其环状DNA，然后在细胞中央形成隔膜，最终分裂成两个遗传物质相同的子细胞。整个过程高效快速，使得原核细胞能够在短时间内实现大量增殖。
真核细胞的分裂过程则复杂得多。体细胞通过有丝分裂进行繁殖，这个过程包括DNA复制、染色体凝聚、纺锤体形成、染色体分离等一系列精密调控的步骤。真核细胞的生长周期被划分为G1期、S期、G2期和M期。G1期是细胞生长和准备DNA复制的阶段，S期进行DNA合成，G2期进行分裂前的最后准备，M期完成细胞分裂。不同类型的真核细胞，其细胞周期长度差异很大。一些快速增殖的肿瘤细胞周期可能只有十几个小时，而某些分化的体细胞可能完全停止分裂，永久停留在G0期。
从上图可以看出，即使同为人类来源的细胞，其细胞周期也存在差异。正常的人成纤维细胞完成一个细胞周期需要约24小时，而肿瘤来源的HeLa细胞只需要约18小时。这种差异反映了肿瘤细胞失去正常生长调控的特性。了解细胞周期的时间分布，对于选择合适的实验时间点、同步化细胞群体等实验设计具有重要意义。
在细胞培养实验中，通常在对数生长期收获细胞进行实验，此时细胞生理状态最佳且最均一。对于需要传代的培养细胞，应该在细胞达到80-90%汇合度时进行传代，避免细胞过度生长进入稳定期而影响细胞活力。
细胞污染的识别与防控
细胞污染是细胞培养中最常见也最棘手的问题。一次污染可能导致数周甚至数月的实验工作付诸东流。更严重的是，某些污染可能不易察觉，导致实验结果出现偏差而研究者却浑然不知。建立严格的无菌观念和污染防控体系，是每一个细胞培养工作者的必修课。
细菌污染是最容易识别的污染类型。当培养基中混入细菌时，原本清澈的培养基会在短时间内变得浑浊，如同牛奶一般。这是因为细菌的生长速度极快，在理想条件下几个小时就能从少量细菌繁殖到上亿个。在显微镜下观察，可以看到大量微小的、折光性强的颗粒在培养基中快速运动。培养基的pH值会迅速改变，原本橙红色的酚红指示剂可能变成黄色（酸性）或紫红色（碱性）。细菌污染的来源多种多样，包括操作者的皮肤和呼吸道、未经彻底消毒的器材、实验室环境中的空气污染等。
真菌污染相比细菌更容易被肉眼观察到。霉菌在培养基中生长时会形成明显的菌丝和孢子，呈现出白色、黑色或绿色的絮状物或斑点。酵母污染则表现为培养基轻度浑浊，显微镜下可见圆形或卵圆形的出芽细胞。真菌污染的特点是发展相对缓慢，可能在污染发生后数天才能被察觉。真菌孢子在空气中普遍存在，当操作环境空气质量差、培养箱清洁不当或长期打开培养皿盖子操作时，就容易发生真菌污染。
支原体污染是最危险也最难以发现的污染类型。支原体是一类缺乏细胞壁的微小原核生物，它们能够通过0.22微米的除菌滤膜，使得常规的除菌措施对它们无效。更麻烦的是，支原体污染通常不引起培养基浑浊，不改变pH值，细胞在支原体污染的情况下仍能生长，只是生长速度可能略有下降。但支原体会显著影响细胞的生理功能，导致实验结果出现偏差。研究表明，实验室中约有15-35%的细胞培养存在支原体污染。支原体可以通过污染的血清、其他被污染的细胞系、实验室气溶胶等途径传播。
除了微生物污染，细胞系之间的交叉污染也是一个严重但常被忽视的问题。当不同的细胞系在同一个生物安全柜内操作，或者共用培养基和器材时，可能发生细胞系混淆。生长速度快的细胞系会逐渐超越并完全取代生长缓慢的细胞系。历史上曾发生过多起著名的细胞系交叉污染事件，其中最著名的是HeLa细胞污染事件。HeLa细胞因其极强的增殖能力，曾污染了全球多个实验室的其他细胞系，导致许多研究结果的可靠性受到质疑。
预防污染的策略需要从多个层面入手。硬件层面，需要保持实验室环境清洁，定期对生物安全柜、培养箱、水浴锅等设备进行清洁和消毒。生物安全柜是细胞培养的第一道防线，使用前应提前打开紫外灯照射30分钟，工作过程中保持柜内整洁有序，避免频繁穿插手臂扰乱气流。培养箱应每月进行一次彻底清洁，使用70%乙醇擦拭内壁，必要时可使用专门的培养箱消毒剂。
操作层面，规范的无菌操作技术是预防污染的关键。进入细胞培养室前应穿戴专用的实验服、口罩和手套，双手需要用肥皂彻底清洗并用70%乙醇消毒。在生物安全柜内操作时，所有器材和试剂瓶都应该用70%乙醇擦拭外表面再带入。移液管和培养瓶的开口应始终朝向操作者，避免朝向生物安全柜的开放区域。操作过程中动作要轻柔稳定，避免产生气溶胶。每次只操作一种细胞系，不同细胞系之间应彻底清理台面并更换手套。
一旦发现细胞培养出现污染，应立即将污染的培养物密封后进行高压灭菌处理，不可直接倒入水槽。污染的培养瓶应单独处理，使用过的生物安全柜需要进行彻底消毒。如果是支原体污染，由于其难以彻底清除的特性，建议废弃该细胞系，从可靠来源重新获取新的细胞。
细胞系的身份认证
细胞系认证是确保实验可靠性的重要环节。使用错误的细胞系进行研究，不仅浪费大量的时间和资源，更可能导致错误的科学结论。随着细胞培养技术的广泛应用，细胞系认证已经成为许多期刊在接收稿件时的强制要求。
细胞系的混淆和错误鉴定问题比我们想象的更为严重。国际细胞库联盟的调查显示，约18-36%的细胞系存在错误鉴定或交叉污染问题。造成这种情况的原因是多方面的。在细胞培养的早期阶段，细胞系的记录和保存不够规范，不同实验室之间交换细胞时缺乏严格的质量控制。一些生长特别快的细胞系，如HeLa细胞，容易在操作不当时污染其他细胞系。还有一些情况是标签混淆或记录错误造成的。
短串联重复序列（STR）分析是目前最广泛使用的细胞系鉴定方法。STR是人类基因组中广泛分布的短序列重复单元，不同个体在特定位点的重复次数存在差异，这种差异可以作为个体识别的“遗传指纹”。STR分析通过检测多个特定基因座的重复次数模式，建立细胞系的独特遗传特征。国际标准通常要求检测至少8个核心STR位点，以及一个性别决定位点。
STR分析的过程包括几个关键步骤。首先从培养的细胞中提取基因组DNA，然后使用多重PCR技术同时扩增多个STR位点。扩增产物通过毛细管电泳进行分离和检测，根据荧光信号确定每个位点的等位基因型。最后将获得的STR图谱与权威数据库中的参考图谱进行比对，判断细胞系的身份。整个过程通常需要2-3天时间，费用在数百到上千元人民币不等。
除了STR分析，还有其他一些细胞系鉴定方法可供选择。形态学观察是最基本的鉴定方法，不同来源的细胞具有特征性的形态特征。上皮细胞通常呈多边形或鹅卵石样排列，成纤维细胞呈梭形并常定向排列，神经细胞可能伸出长突起。但形态学观察主观性强，且某些细胞系的形态可能随培养条件改变。染色体核型分析可以检查染色体的数目和结构，但操作复杂且需要专业技能。同工酶分析曾经是常用的鉴定方法，但灵敏度和特异性都不如STR分析。
上图展示了不同细胞系鉴定方法的综合评价（评分范围1-10，操作难度和成本分数越高表示越简单和越便宜）。可以看出，STR分析在准确性和灵敏度方面具有明显优势，尽管操作相对复杂且成本较高，但其可靠性使其成为金标准。形态观察虽然简单易行，但准确性有限，只能作为初步判断的辅助手段。
建立良好的细胞系管理制度对于防止细胞系混淆至关重要。每个新引入实验室的细胞系都应该进行STR鉴定并建立档案。细胞培养瓶上的标签应该清晰标注细胞系名称、传代次数、操作日期和操作者姓名。建议为每个细胞系建立主细胞库和工作细胞库，主细胞库在液氮中长期保存，不轻易使用；工作细胞库用于日常实验，定期从主细胞库复苏补充。对于长期传代的细胞系，应定期进行STR鉴定，确认其身份未发生改变。
许多国家和地区建立了权威的细胞库，如美国的ATCC、中国的中科院细胞库、日本的JCRB等。从这些正规细胞库获取细胞系，能够获得经过严格质控和鉴定的细胞，并附有详细的培养说明和STR数据，大大降低了使用错误细胞系的风险。
无菌操作的核心技术
无菌操作技术是细胞培养成败的关键。即使拥有最先进的设备和最昂贵的试剂，如果无菌操作不规范，也难以获得成功的培养结果。掌握无菌操作技术不是一蹴而就的，需要通过反复练习形成良好的操作习惯。
生物安全柜是进行无菌操作的核心设备。常用的二级生物安全柜通过高效空气过滤系统（HEPA）和层流气流设计，在操作区域建立一个洁净的环境。室内空气经过预过滤后被吸入安全柜，通过HEPA过滤器后形成垂直向下的层流气流，覆盖整个工作区域。工作区域的空气部分被排出，部分循环回到顶部重新过滤。这种设计既保护操作的细胞不被环境污染，也保护操作者不受生物危害因子的伤害。
使用生物安全柜前的准备工作不可忽视。应提前30分钟打开安全柜的风机和照明，让气流稳定。同时打开紫外灯进行表面消毒，紫外线能够破坏微生物的DNA，但穿透力有限，只能消毒表面。紫外灯照射30分钟后关闭，因为紫外线对眼睛和皮肤有伤害，操作时不应开启紫外灯。用70%乙醇彻底擦拭安全柜的工作台面，乙醇既能消毒又能快速挥发，不会留下残留。
在生物安全柜内的物品摆放也有讲究。清洁区和污染区应该明确分开，通常将清洁的移液管、培养基等放在一侧，使用过的移液管和废液容器放在另一侧。培养瓶和培养板应该尽量远离前窗开口，在安全柜的后三分之一区域操作最为安全。物品不应摆放过多过密，避免阻碍气流流动。所有物品进入安全柜前都应该用70%乙醇擦拭外表面。
移液操作是细胞培养中最频繁的操作，也是最容易导致污染的环节。打开移液管包装时，应该从纸包装的一端撕开，不要用手直接接触移液管的吸取端。将移液管连接到移液器上后，吸取液体时要缓慢平稳，避免液体溅入移液器内部。移液时移液管尖端应该保持在容器口内，不要在空气中暴露。一次性移液管使用后应立即丢弃到专用的废弃物容器中，绝不能重复使用。
培养瓶和培养板的开盖操作需要特别小心。原则是尽量缩短开盖时间，开盖时瓶盖或板盖应该面朝下放置，避免内表面接触台面。培养瓶倾斜30-45度角打开，瓶口不要朝向操作者或安全柜的前开口。加入或吸出培养基时，移液管不应接触瓶口。操作完成后立即盖上盖子。对于多孔板，可以只打开需要操作的几个孔，其余部分保持盖板覆盖。
火焰灭菌是另一种重要的无菌操作方法，主要用于玻璃器皿的瓶口灭菌。将玻璃瓶口在酒精灯火焰上快速通过2-3次，高温能够杀死附着在瓶口的微生物。但要注意火焰灭菌不适用于塑料器材，因为塑料会熔化变形。在配备生物安全柜的现代实验室，火焰灭菌的使用已经大大减少，因为明火可能干扰安全柜的层流气流，并且存在安全隐患。
个人的无菌意识是无菌操作成功的基础。进入细胞培养室前应该充分准备，将需要的所有物品准备齐全，避免频繁进出。操作过程中不要交谈、不要咳嗽打喷嚏，如果必须咳嗽或打喷嚏，应该转身离开安全柜。头发应该束起或戴帽子，避免头发掉落到工作区域。手机等个人物品不应带入操作区域。操作时动作应该轻柔稳定，避免产生气溶胶或扬起灰尘。
无菌操作的核心原则是建立"无菌区域"的概念，明确什么是无菌的、什么是有污染风险的。任何无菌物品一旦接触非无菌表面，就不再无菌。培养基、细胞悬液等一旦打开，就处于暴露状态，操作要尽快完成。养成良好的无菌操作习惯，需要将这些原则内化为自然而然的行为模式。
小结
细胞培养基础是生物技术研究中的核心技能。我们了解了原核细胞与真核细胞在结构和培养需求上的本质差异，掌握了细胞生长的四个阶段及其特征，认识到细胞污染的危害和防控策略，理解了细胞系鉴定的重要性和方法，并学习了无菌操作的核心技术。
成功的细胞培养不仅依赖于理论知识，更需要在实践中不断磨练操作技能。每一次无菌操作都是对细心和耐心的考验，每一次培养观察都是对细胞生长规律的深入理解。随着经验的积累，你会逐渐建立起对细胞状态的敏锐判断力，能够从细胞的形态、生长速度、培养基的细微变化中察觉潜在的问题。
在接下来的学习中，我们将进一步探讨细胞培养基的组成和配制原理，了解不同类型细胞的特殊培养需求，这将帮助我们更好地掌握细胞培养这门既是科学又是艺术的技术。