细胞培养基

细胞培养基是细胞在体外生长和繁殖的基础，就如同土壤之于植物，水体之于鱼类。在现代生物技术实验室中，无论是基础研究还是工业化生产，培养基的配制都是一项至关重要的技术。从简单的细菌培养基到复杂的哺乳动物细胞培养基，每一种培养基都经过精心设计，以满足特定细胞的生长需求。

等渗溶液的原理与应用

在讨论培养基之前，我们必须先理解一个基本概念——等渗性。细胞膜是一层半透膜，水分子可以自由通过，但溶质分子的通过受到限制。当细胞处于不同渗透压的环境中时，水分子会发生净移动，这个过程称为渗透。

渗透压是由溶液中溶质粒子的浓度决定的。以红细胞为例，其内部溶液的渗透压约为300毫渗摩尔每升（mOsm/L）。当我们将红细胞放入不同渗透压的溶液中，会观察到三种不同的现象。

在等渗溶液中，溶液的渗透压与细胞内液相等，水分子进出细胞的速率相同，细胞保持正常形态。这就像两个水位相同的容器通过管道连接，水不会发生净流动。常用的等渗溶液包括0.9%的氯化钠溶液（生理盐水）和5%的葡萄糖溶液。

在低渗溶液中，外部溶液的渗透压低于细胞内液，水分子会大量进入细胞，导致细胞膨胀甚至破裂。这种现象在临床上称为溶血。想象一下将晒干的海带放入清水中，海带会迅速吸水膨胀，细胞在低渗环境中也会发生类似的变化。

在高渗溶液中，外部溶液的渗透压高于细胞内液，水分子会从细胞内流出，导致细胞皱缩。这就像腌制咸菜的过程，高浓度的盐溶液会将蔬菜细胞中的水分吸出，使蔬菜变得软塌。

在下图中，纵轴表示细胞体积的相对百分比，横轴表示时间。当细胞处于等渗溶液中时，细胞内外的渗透压保持平衡，水分子进出速率相同，因此细胞体积始终稳定。曲线显示，整个过程中细胞体积没有发生变化，维持在初始水平，反映了等渗环境下细胞的稳定状态。

渗透压的测量通常使用渗透压计，该仪器通过测量溶液的冰点下降来计算渗透压。纯水的冰点是0℃，当溶液中含有溶质时，冰点会降低，溶质浓度越高，冰点下降越多。这个原理在日常生活中也有应用，比如冬天在路面上撒盐可以降低冰点，防止结冰。

在配制培养基时，我们需要特别注意各种盐类成分的添加量。氯化钠是最主要的渗透压调节剂，但钾盐、钙盐、镁盐等也会对渗透压产生影响。以标准的磷酸盐缓冲液（PBS）为例，其配方经过精心计算，确保最终溶液的渗透压与生理条件相匹配。

这个配方溶解在1升蒸馏水中，最终渗透压约为300 mOsm/L，pH值为7.4，非常接近人体生理环境。

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细菌培养基的类型与制备

细菌是最容易培养的微生物，因为它们的营养需求相对简单，生长速度快。细菌培养基根据成分的明确程度和功能，可以分为多种类型。

从成分的角度看，培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。天然培养基使用天然物质配制，如牛肉膏、蛋白胨等。这类培养基的优点是营养丰富，大多数细菌都能良好生长，但缺点是成分不明确，批次间可能存在差异。上海的一些传统微生物实验室至今仍在使用牛肉膏蛋白胨培养基培养大肠杆菌，这种培养基已有百年历史。

合成培养基完全由已知化学成分配制而成，每种成分的种类和用量都明确。这类培养基的优点是成分恒定，重复性好，便于研究细菌的代谢途径，但成本较高，配制复杂。半合成培养基则介于两者之间，既包含天然成分，也包含已知的化学物质。

从功能的角度看，培养基又可分为基础培养基、选择性培养基、鉴别培养基和富集培养基。基础培养基能够支持大多数非挑剔微生物的生长，如营养肉汤和营养琼脂。选择性培养基通过添加抑制剂，只允许特定微生物生长。例如，伊红美蓝琼脂（EMB）含有染料，可以抑制革兰氏阳性菌的生长，用于分离革兰氏阴性菌。

鉴别培养基在培养基中加入某些指示剂，使不同微生物在培养基上呈现不同的特征，从而便于鉴别。血平板就是一个经典的例子，不同细菌在血平板上产生不同类型的溶血反应。溶血性链球菌会产生透明的β-溶血环，草绿色链球菌产生绿色的α-溶血环，而不溶血的细菌则不改变培养基颜色。

富集培养基则含有特殊的营养物质，用于培养营养要求高的细菌。例如，巧克力琼脂培养基是在血琼脂基础上加热制成的，加热过程使红细胞破裂，释放出血红蛋白和其他生长因子，培养基呈巧克力色，故得名。这种培养基常用于培养淋球菌和流感嗜血杆菌等挑剔的病原菌。

配制细菌培养基的基本步骤包括称量、溶解、调节pH值、灭菌和分装。称量时要准确，使用精密天平称取各种成分。溶解时应先将各成分溶于少量蒸馏水中，然后再定容至所需体积。对于不易溶解的物质，可以适当加热或搅拌。

pH值的调节非常重要，因为细菌的生长有最适pH范围。大多数细菌的最适pH为7.0-7.5，但也有例外。例如，霍乱弧菌喜欢碱性环境，最适pH为8.5-9.0；而乳酸杆菌喜欢酸性环境，最适pH为5.5-6.5。调节pH值可以使用氢氧化钠溶液或盐酸溶液。

灭菌是配制培养基的关键步骤。大多数培养基采用高压蒸汽灭菌，温度121℃，时间15-20分钟。但某些对热敏感的成分，如糖类、维生素、抗生素等，需要单独灭菌或采用过滤除菌的方法。过滤除菌使用0.22微米的滤膜，可以去除细菌但不破坏热敏感成分。

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LB培养基的配制实例

LB（Lysogeny Broth）培养基，又称LB肉汤或LB琼脂，是分子生物学实验室中最常用的细菌培养基之一。它最初由Giuseppe Bertani在1951年开发，用于研究溶原性噬菌体，因此得名。经过几十年的使用，LB培养基已成为培养大肠杆菌的标准培养基。

LB培养基的成分简单，主要包含三种成分：胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠。胰蛋白胨是蛋白质经胰酶水解后得到的多肽和氨基酸混合物，为细菌提供氮源和碳源。酵母提取物富含B族维生素和微量元素，为细菌生长提供生长因子。氯化钠则维持渗透压平衡。

配制1升LB液体培养基的标准配方如下：

配制过程首先是称量。使用电子天平分别称取10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠，将它们加入一个2升的烧瓶中。然后加入约800毫升的蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。胰蛋白胨和酵母提取物的溶解可能需要一些时间，如果在室温下溶解较慢，可以稍微加热至50℃左右，但温度不宜过高，以免破坏某些营养成分。

待所有成分完全溶解后，用蒸馏水定容至1000毫升。此时应该测量溶液的pH值，标准LB培养基的pH应该在7.0左右。如果pH偏离较多，可以用1 M的氢氧化钠溶液或1 M的盐酸溶液进行调节。不过，使用质量可靠的原料时，通常不需要调节pH。

接下来是灭菌。将配制好的培养基分装到合适的容器中，通常使用500毫升或1000毫升的培养基瓶。瓶口用铝箔纸或硅胶塞封好，但不要拧太紧，以免灭菌时内部气压过大导致瓶子破裂。在高压灭菌锅中，121℃灭菌15-20分钟。

如果要制备LB固体培养基（LB琼脂），需要在上述配方中额外添加15克琼脂粉（最终浓度1.5%）。琼脂是从红藻中提取的多糖，在高温下溶解，冷却后凝固成凝胶状。配制方法与液体培养基基本相同，但由于琼脂不易溶解，需要在高压灭菌过程中才能完全熔化。

灭菌后的LB琼脂在冷却至约50℃时，可以倒平板。选择一个无菌环境，如超净工作台，将培养基倒入无菌平皿中，每个平皿约20-25毫升。倒入后盖上盖子，待其自然冷却凝固。凝固后的平板可以倒置保存，防止冷凝水滴落到琼脂表面。

北京大学的一个本科实验课程中，学生们学习配制LB培养基并培养大肠杆菌。教师特别强调了无菌操作的重要性，因为任何污染都会影响实验结果。学生们配制的培养基用于转化实验，将含有绿色荧光蛋白基因的质粒导入大肠杆菌，成功转化的菌落在紫外光下会发出绿色荧光。

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哺乳动物细胞培养基

与细菌相比，哺乳动物细胞的培养要复杂得多。哺乳动物细胞对营养和环境条件的要求非常苛刻，培养基的成分必须经过精心设计。一个完整的哺乳动物细胞培养基通常包含十几种氨基酸、多种维生素、无机盐、葡萄糖、生长因子和血清等成分。

哺乳动物细胞培养基的发展历史反映了人们对细胞营养需求认识的不断深化。1950年代，Eagle等科学家通过系统研究，确定了细胞生长所需的最低营养成分，开发出了MEM（Minimal Essential Medium，最低必需培养基）。MEM包含12种氨基酸、8种维生素、多种无机盐和葡萄糖。

随后，研究人员在MEM的基础上不断改进，开发出了多种培养基。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）是在MEM基础上增加了氨基酸和维生素的浓度，特别适合培养生长快速的细胞。RPMI-1640最初为白血病细胞开发，含有更多种类的氨基酸和维生素，现已广泛用于各种哺乳动物细胞的培养。

氨基酸是培养基中最重要的营养成分之一。人体需要20种氨基酸合成蛋白质，其中12种可以由细胞自身合成，称为非必需氨基酸；另外8种必须从培养基中获取，称为必需氨基酸。培养基中必须提供所有必需氨基酸和部分非必需氨基酸。

谷氨酰胺是培养基中含量最高的氨基酸，不仅是蛋白质合成的原料，还是细胞的重要能源物质。但谷氨酰胺在溶液中不稳定，会自发分解产生氨和焦谷氨酸，因此通常在使用前才加入培养基中。

维生素在细胞代谢中起辅酶作用。培养基中通常含有B族维生素，如硫胺素（维生素B1）、核黄素（维生素B2）、烟酰胺、泛酸、吡哆醇（维生素B6）等。这些维生素参与糖代谢、氨基酸代谢和核酸合成等重要过程。

无机盐不仅维持渗透压平衡，还参与多种生理功能。钠、钾、钙、镁是主要的阳离子，氯、磷酸根、碳酸氢根是主要的阴离子。其中，碳酸氢钠起着重要的缓冲作用，与培养箱中的二氧化碳形成缓冲体系，维持培养基的pH值在7.2-7.4。

葡萄糖是细胞的主要能量来源。大多数哺乳动物细胞通过糖酵解和三羧酸循环代谢葡萄糖，产生ATP供细胞使用。标准培养基中的葡萄糖浓度通常为1000 mg/L（5.5 mM），但快速生长的细胞可能需要更高的葡萄糖浓度，如DMEM中的葡萄糖浓度可达4500 mg/L。

血清是哺乳动物细胞培养基中最复杂的成分，我们将在下一节详细讨论。除了血清，许多培养基还需要添加特定的生长因子，如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素等，以促进特定类型细胞的生长。

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血清与无血清培养基

血清是血液凝固后分离出的淡黄色液体，含有大量的生长因子、激素、转运蛋白、结合蛋白和微量元素。自细胞培养技术诞生以来，血清一直是培养基中不可或缺的成分，特别是胎牛血清（FBS，Fetal Bovine Serum）被认为是最好的血清来源。

胎牛血清从未出生的小牛胎儿心脏中采集，因此含有较少的抗体和较多的生长因子。血清中的成分极其复杂，已鉴定出的成分有数千种，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等。这些成分协同作用，为细胞提供了一个接近体内的生长环境。

白蛋白是血清中含量最高的蛋白质，约占血清蛋白的50-60%。它具有多种功能：作为pH缓冲剂稳定培养基pH值；结合和运输脂肪酸、激素和维生素；保护细胞免受机械损伤；作为渗透压调节剂。转铁蛋白负责运输铁离子，铁是细胞生长必需的微量元素，参与血红蛋白合成和多种酶的组成。

血清还含有多种生长因子，这些小分子蛋白通过与细胞表面受体结合，激活细胞内信号通路，促进细胞增殖和分化。例如，血小板衍生生长因子（PDGF）促进成纤维细胞增殖；表皮生长因子（EGF）促进上皮细胞生长；胰岛素样生长因子（IGF）促进多种细胞的生长和代谢。

上海某生物制药公司在生产单克隆抗体时，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养杂交瘤细胞。这些细胞在生物反应器中大规模培养，产生的抗体用于肿瘤治疗。该公司每年要使用数千升血清，成本相当可观。

然而，使用血清也带来了一系列问题。首先是成本问题，高质量的胎牛血清价格昂贵，而且价格波动大。其次是批次差异问题，不同批次的血清成分存在差异，可能影响细胞生长和实验结果的重复性。第三是污染风险，血清可能携带病毒、支原体或朊病毒等病原体。最后，从伦理角度考虑，采集胎牛血清涉及动物福利问题。

为了解决这些问题，科学家们开发了无血清培养基。无血清培养基不含血清，而是添加了明确的化学成分来替代血清的功能。这些成分包括重组蛋白（如白蛋白、转铁蛋白、胰岛素）、脂肪酸、微量元素和特定的生长因子。

开发无血清培养基是一个复杂的过程，需要深入了解细胞的营养需求。首先要确定细胞生长所需的关键生长因子，然后优化这些因子的浓度和组合。不同类型的细胞需要不同的无血清培养基配方。例如，CHO（中国仓鼠卵巢）细胞广泛用于生产重组蛋白药物，已有多种商业化的CHO细胞无血清培养基。

无血清培养基的优势显而易见：成分明确，批次稳定；无病原体污染风险；便于下游纯化；符合药品生产规范（GMP）要求。但也存在一些挑战：开发成本高；细胞适应期长；生长速度可能不如血清培养基。

深圳某生物技术公司专门开发无血清培养基，他们的产品已成功应用于多家制药企业的蛋白药物生产。该公司的研发总监表示，随着生物制药行业的快速发展和监管要求的提高，无血清培养基的市场需求将持续增长。

在实际应用中，许多实验室采用逐步降低血清浓度的策略，让细胞逐渐适应低血清或无血清环境。最初使用含10%血清的培养基培养细胞，然后逐步降低至5%、2%、1%，最后过渡到完全无血清培养基。这个过程可能需要数周时间，期间要密切监测细胞的生长状况。

细胞培养基的发展反映了生物技术的进步。从最初的天然血清到现在的无血清、化学成分明确的培养基，每一次改进都是科学认识深化的结果。随着合成生物学和系统生物学的发展，未来的培养基将更加精准地满足细胞需求，为生物医药、再生医学等领域的发展提供坚实基础。