光学测量技术

在现代生物技术实验室中，光学测量技术扮演着不可或缺的角色。从简单的蛋白质浓度测定，到复杂的核酸定量分析，几乎所有的生物化学检测都离不开光学测量手段。分光光度计作为实验室中最常用的仪器之一，其工作原理建立在光与物质相互作用的基础之上。理解光学测量的基本原理，不仅能帮助我们正确操作仪器，更能让我们深入理解实验数据背后的科学本质。

本内容将介绍光学测量技术的基础知识，从光的基本性质出发，逐步深入到电磁波谱、光与物质的相互作用机制，最后详细讲解分光光度计的设计原理和性能验证方法。通过学习，我们将能够理解为什么我们可以通过测量光的吸收来确定物质的浓度，以及如何确保测量结果的准确性和可靠性。

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光的基本性质

光是一种电磁波，同时具有波动性和粒子性。这种波粒二象性是量子力学的重要概念，但在实验室的日常测量中，我们主要关注光的波动特性。理解光的基本物理参数，是掌握光学测量技术的第一步。

光的波动特性

当光在空间中传播时，它表现为电场和磁场的周期性振荡。这种振荡可以用波长、频率和能量三个基本参数来描述。波长是指相邻两个波峰之间的距离，通常用希腊字母λ（lambda）表示，单位为纳米（nm）或微米（μm）。频率是指单位时间内通过某一点的完整波的数目，用ν（nu）表示，单位为赫兹（Hz）。能量则与频率成正比，反映了光子携带的能量大小。

这三个参数之间存在着紧密的数学关系。光在真空中的传播速度恒定为3.0×10⁸米每秒，记作c。波长与频率的乘积等于光速，即λν=c。这个简单的公式揭示了一个重要事实：波长越短的光，频率就越高。而根据普朗克方程E=hν，其中h是普朗克常数（6.626×10⁻³⁴ J·s），频率越高的光携带的能量就越大。因此，波长与能量成反比关系，波长越短，光子能量越高。

在生物技术实验室中，我们最常使用的是紫外光（UV）和可见光（Visible）区域。可见光的波长范围约为380-780纳米，这正是人眼能够感知的范围。不同波长的可见光呈现不同的颜色：380-450纳米为紫色，450-495纳米为蓝色，495-570纳米为绿色，570-590纳米为黄色，590-620纳米为橙色，620-780纳米为红色。紫外光的波长范围通常定义为200-400纳米，虽然人眼无法看到，但在生物分子测量中极为重要。

光的传播和折射

当光从一种介质进入另一种介质时，传播速度会发生改变，这种现象称为折射。每种物质都有其特定的折射率，定义为光在真空中的速度与在该物质中速度的比值。水的折射率约为1.33，普通玻璃约为1.5，而空气接近1.0。折射率的差异导致了光路的弯曲，这正是透镜能够聚焦光线的物理基础。

在分光光度计中，光学元件如棱镜和透镜广泛利用了折射现象。棱镜能够将白光分解成不同颜色的光，这是因为不同波长的光在同一介质中的折射率略有差异，这种现象称为色散。正是利用色散效应，分光光度计才能从复杂的混合光中分离出特定波长的单色光。

光的强度和衰减

光的强度是指单位时间内通过单位面积的光能量，通常用辐照度来表示，单位为瓦特每平方米（W/m²）。在光学测量中，我们更关心的是光通过样品后强度的变化。当光通过物质时，其强度会发生衰减，这种衰减主要来自三个过程：吸收、散射和反射。

吸收是指光的能量被物质分子吸收并转化为其他形式能量的过程。对于生物分子而言，当光子的能量恰好等于分子中电子跃迁所需的能量时，光子就会被吸收。这种选择性吸收是分光光度测量的理论基础。散射是指光遇到微小粒子或不均匀介质时，传播方向发生改变。在浑浊溶液或含有细胞悬浮液的样品中，散射会显著影响测量结果。反射则发生在光遇到界面时，部分光被反射回去而不进入样品。

北京大学生命科学学院的研究人员在进行蛋白质浓度测定时发现，样品管的清洁度对测量结果有明显影响。通过对比实验发现，未清洁的比色皿由于表面污染造成的散射和反射，可使测量误差增加15%以上。这个案例说明，在光学测量中，样品容器的选择和清洁至关重要。

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电磁波谱

电磁波谱是按照波长或频率排列的所有电磁辐射的集合。从波长极长的无线电波，到波长极短的伽马射线，电磁波谱涵盖了超过20个数量级的范围。在这个庞大的家族中，可见光仅占据极小的一部分，但正是这一部分以及邻近的紫外光和红外光区域，构成了生物技术实验室光学测量的主要工作范围。

电磁波谱的区域划分

整个电磁波谱可以根据波长划分为若干区域，每个区域的电磁波具有不同的性质和应用。无线电波的波长最长，从几毫米到几千米不等，主要用于通信和广播。微波的波长范围为1毫米至1米，除了通信应用外，微波加热也是实验室中常见的技术。红外光的波长范围为780纳米至1毫米，虽然人眼看不见，但可以感受到其热效应。

可见光区域是电磁波谱中人眼能够感知的部分，波长范围为380-780纳米。这个范围的选择并非偶然，而是生物进化的结果。太阳光辐射在可见光波段最为强烈，生物体在长期进化过程中，视觉系统适应了这一波段。紫外光的波长短于可见光，范围为10-400纳米，根据波长又可细分为UVA（320-400nm）、UVB（280-320nm）和UVC（200-280nm）。X射线和伽马射线的波长更短，能量更高，在生物技术中主要用于结构分析和成像技术。

紫外

在生物技术实验室中，紫外-可见光区域（通常简称UV-Vis区域）是应用最广泛的波段。这个区域涵盖了约200-800纳米的波长范围，恰好对应于许多生物分子的电子跃迁能量。蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）在280纳米附近有强吸收，而肽键在远紫外区（190-220nm）有吸收。核酸的碱基在260纳米附近有最大吸收，这使得我们可以方便地通过测量260纳米的吸光度来定量DNA和RNA。

图中显示了DNA在不同波长紫外光下的吸收曲线。可以看到，DNA在260纳米处的吸光度最大（λmax=260nm），这是核酸分子中特有的吸收峰。其余波长下吸光度较低，说明DNA对260纳米附近的紫外光具有特异性强吸收。这一特性被广泛用于DNA和RNA的定量分析，例如通过测量260纳米的吸光度可以计算核酸的浓度。

中国科学院上海生命科学研究院在进行基因表达研究时，经常需要测定RNA的浓度和纯度。研究人员发现，通过测量260纳米和280纳米处的吸光度比值（A260/A280），可以快速评估RNA样品的纯度。纯净的RNA样品该比值约为2.0，如果比值偏低，说明样品中可能含有蛋白质污染。这种简单快速的质量控制方法，已成为分子生物学实验的标准操作。

不同波长的能量差异

电磁波的能量与波长成反比，这意味着波长越短的光子携带的能量越高。这种能量差异决定了不同波段电磁波与物质相互作用的方式。低能量的无线电波和微波主要引起分子的转动，红外光引起分子的振动，而可见光和紫外光的能量足以引起电子跃迁。

在260纳米处，光子的能量约为4.77电子伏特（eV），这个能量刚好可以激发核酸碱基中的π电子。而在280纳米处，能量约为4.43电子伏特，可以激发蛋白质芳香族氨基酸中的电子。这种精确的能量匹配，使得UV-Vis光谱法成为生物分子定量和定性分析的有力工具。

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光与物质的相互作用

当光穿过物质时，会发生多种复杂的相互作用。这些相互作用包括吸收、散射、反射和透射，它们共同决定了光通过样品后的强度变化。在分光光度测量中，我们主要关注吸收现象，因为物质对特定波长光的吸收程度直接反映了该物质的浓度。

光吸收的分子机制

光的吸收本质上是一个量子过程。当光子的能量恰好等于分子中两个能级之间的能量差时，光子就会被吸收，分子从低能级跃迁到高能级。对于有机分子而言，这种跃迁通常涉及价电子，特别是π电子和n电子。共轭双键体系中的π电子特别容易被可见光或紫外光激发，这就是为什么许多有色物质都含有共轭结构。

以核酸为例，DNA和RNA的碱基结构中含有芳香环和共轭双键系统。当260纳米的紫外光照射时，碱基中的π电子从基态π轨道被激发到反键π轨道，这种π→π跃迁吸收了光子能量。被激发的分子处于不稳定状态，很快会通过多种途径释放能量回到基态，如发射荧光、产生热量或引发化学反应。

蛋白质的光吸收主要来自三个方面。首先是肽键的吸收，肽键中的n电子在190-220纳米范围有吸收，但这个波长范围接近许多溶剂的吸收区，实际测量中较少使用。其次是芳香族氨基酸的吸收，色氨酸在280纳米附近有强吸收，酪氨酸在275纳米有吸收，苯丙氨酸在257纳米有弱吸收。第三是蛋白质中如果含有辅基（如血红蛋白的血红素），这些辅基往往在可见光区有特征吸收。

朗伯-比尔定律

朗伯-比尔定律是定量分光光度分析的理论基础，它描述了光通过均匀介质时吸光度与浓度和光程的关系。该定律可以表述为：A=εcl，其中A是吸光度，ε是摩尔吸光系数，c是溶液浓度，l是光程长度。吸光度A定义为入射光强度I₀与透射光强度I的比值的负对数，即A=-log₁₀(I/I₀)。

摩尔吸光系数ε是物质的特征常数，反映了该物质吸收特定波长光的能力。ε值越大，说明该物质在该波长处的吸收越强。对于纯DNA而言，在260纳米处的摩尔吸光系数约为6600 L·mol⁻¹·cm⁻¹（以核苷酸为单位）。这意味着1摩尔每升浓度的DNA溶液，在1厘米光程下，260纳米处的吸光度约为6600。

朗伯-比尔定律的成立需要满足几个条件。首先，入射光必须是单色光，因为不同波长的光吸光系数不同。其次，溶液必须是均匀的稀溶液，高浓度时分子间相互作用会导致偏离线性关系。第三，光的强度不能太高，强光可能导致受激发射等非线性效应。在实际应用中，我们通常将吸光度控制在0.1-1.0之间，这个范围内测量误差最小。

清华大学生命科学学院的研究团队在进行蛋白质定量实验时，系统比较了不同浓度范围的测量精度。实验结果显示，当蛋白质浓度在0.1-1.0 mg/mL范围内时，吸光度与浓度呈良好的线性关系，相关系数R²可达0.999以上。但当浓度超过2.0 mg/mL后，测量值开始偏离线性，这时需要对样品进行适当稀释后再测量。

散射和浊度

除了吸收，散射也是光与物质相互作用的重要方式。当光遇到尺寸与波长相近或更大的粒子时，会发生散射，使光的传播方向发生改变。在生物样品中，细胞、细胞器、蛋白质聚集体等都可能引起光散射。散射光的一部分会偏离原来的传播方向，无法到达检测器，导致透射光强度降低，表现为“表观吸光度”的增加。

浊度测量正是利用了光散射原理。在微生物培养中，我们常通过测量600纳米处的吸光度（OD₆₀₀）来监测细菌生长。此时测得的并非真正的吸收，而主要是散射造成的光强衰减。细菌浓度越高，散射越强，OD₆₀₀值就越大。这种方法简便快速，已成为微生物学实验的标准操作。

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分光光度计的基本设计

分光光度计是实验室中最常用的分析仪器之一，其基本功能是测量物质对特定波长光的吸收程度。虽然现代分光光度计有许多先进功能，但其核心设计原理已经确立数十年，包括光源、单色器、样品室、检测器和信号处理系统五个基本部分。理解这些组件的工作原理，对于正确操作仪器和解释测量结果至关重要。

光源系统

分光光度计的光源需要能够产生稳定的、涵盖所需波长范围的光。对于紫外-可见分光光度计，通常配备两种光源。钨灯是可见光和近红外区（320-2500nm）的常用光源，它通过加热钨丝至高温（约3000K）产生连续光谱。氘灯则是紫外区（190-400nm）的标准光源，它通过氘气放电产生富含紫外光的连续光谱。

这两种光源各有特点。钨灯的优点是寿命长（通常2000小时以上）、价格低廉、光谱稳定，但在紫外区发光较弱。氘灯在紫外区有很强的发光，但寿命相对较短（约1000小时）、价格较高。现代仪器通常在320纳米附近自动切换光源，使用氘灯覆盖紫外区，钨灯覆盖可见区，从而在整个波长范围内获得最佳性能。

上海交通大学生物医学工程学院对实验室多台分光光度计进行了光源性能评估。研究发现，氘灯使用超过800小时后，紫外区的光强会明显下降，导致在低吸光度测量时信噪比降低。因此建议定期监测光源性能，及时更换老化的灯管，以确保测量精度。

单色器与波长选择

单色器的作用是从光源发出的连续光谱中分离出所需波长的光。最常用的单色器有两种类型：棱镜型和光栅型。棱镜利用不同波长光的折射率差异来分光，而光栅则利用衍射原理。现代仪器多采用光栅单色器，因为它具有更高的分辨率和更均匀的色散。

光栅由密集排列的平行刻线组成，典型的光栅每毫米有数百至数千条刻线。当光照射到光栅上时，会发生衍射，不同波长的光衍射角度不同，从而实现分光。通过旋转光栅，可以让不同波长的光通过出射狭缝到达样品。狭缝的宽度决定了光谱带宽，狭缝越窄，单色性越好，但通过的光强越弱。

光谱带宽是单色器的重要性能指标，它表示实际通过的不是单一波长，而是一个波长范围。典型的实验室分光光度计光谱带宽为1-5纳米。对于具有宽吸收峰的样品，较大的光谱带宽影响不大。但对于具有窄吸收峰或精细结构的样品，需要使用较小的光谱带宽以获得准确的光谱信息。

样品室设计

样品室是放置比色皿的地方，也是光与样品发生相互作用的场所。标准的样品室设计能容纳四个比色皿，包括样品、参比和两个备用位置。比色皿通常由石英或玻璃制成，光程标准为1厘米。石英比色皿可以透过紫外光，适用于190-2500纳米的全波长范围，而普通玻璃比色皿只能用于340纳米以上的可见光区。

比色皿的质量对测量精度有重要影响。高质量的比色皿光学面平整光滑、平行度好、光程长度准确。使用前应检查比色皿是否清洁，任何指纹、污渍或划痕都会影响光的透射。不同比色皿之间即使是同一批次，也可能存在细微差异，因此在进行精密测量时，应使用同一对比色皿进行样品和参比的测量。

温度对某些样品的吸收光谱有明显影响，特别是蛋白质溶液和核酸溶液。高档分光光度计配备有恒温样品室，可以将温度控制在设定值±0.1℃范围内。北京协和医学院的研究表明，在进行酶活性测定时，温度控制的重要性尤为突出。温度每变化1℃，某些酶的活性可能变化5-10%，直接影响实验结果的重现性。

检测器与信号处理

检测器的作用是将透过样品的光信号转换为电信号。早期的分光光度计使用光电倍增管（PMT）作为检测器，它具有极高的灵敏度，可以检测到极微弱的光信号。现代仪器越来越多地采用硅光电二极管或光电二极管阵列（PDA）检测器，它们具有良好的线性响应、稳定性高、寿命长的优点。

光电二极管阵列检测器是一种特殊的检测器，它由数百至数千个光电二极管排列而成，每个二极管对应一个特定的波长。这种设计使得仪器可以同时测量多个波长的吸光度，大大加快了光谱扫描速度。传统单色器扫描一个光谱需要几分钟，而PDA检测器可以在不到一秒钟内完成，这对于研究快速变化的反应过程特别有用。

信号处理系统接收检测器输出的电信号，经过放大、模数转换等处理后，计算出吸光度值。现代仪器的信号处理系统都是数字化的，配备有微处理器和专用软件，不仅可以进行数据采集，还能进行数据处理、图谱显示、结果存储等多种功能。一些高级软件还具有光谱比对、导数光谱、多组分分析等功能，大大扩展了分光光度计的应用范围。

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分光光度计的性能验证

即使是最精密的仪器，也需要定期进行性能验证以确保测量结果的准确性和可靠性。分光光度计的性能验证包括波长准确度、光度准确度、杂散光、噪声和基线稳定性等多个方面。了解这些性能指标的含义和测试方法，不仅有助于判断仪器是否处于良好工作状态，也能帮助我们在遇到异常结果时快速定位问题。

波长准确度与重现性

波长准确度是指仪器显示的波长与实际波长的符合程度。即使波长偏差很小，也可能导致吸光度测量的明显误差，特别是在吸收峰陡峭的区域。波长准确度的验证通常使用具有已知吸收峰的标准物质，如氧化钬溶液或氧化铒溶液。

氧化钬溶液在紫外-可见区有多个特征吸收峰，在241.5、287.2、361.5、536.3和637.5纳米处有明显的吸收峰。测量这些峰位，与标准值比较，偏差应在±1纳米以内。如果发现波长偏差过大，需要进行波长校准。大多数现代仪器都有自动波长校准功能，使用内置的标准滤光片或汞灯的特征谱线进行校准。

波长重现性是指仪器重复测量同一波长时的一致性。良好的波长重现性是获得可靠数据的保证。测试方法是在同一天内多次测量标准物质的吸收峰位置，计算标准偏差。通常要求波长重现性优于±0.2纳米。

光度准确度与线性

光度准确度是指仪器测得的吸光度值与真实值的符合程度。验证光度准确度常用重铬酸钾溶液作为标准物质，因为它在紫外区有稳定的吸收。例如，在硫酸溶液中，浓度为60 mg/L的重铬酸钾在257纳米处的吸光度应为0.536±0.010（1cm光程）。

光度线性描述了仪器测量的吸光度与真实吸光度之间的线性关系。理想情况下，这应该是完美的线性关系，即测量值与真实值之间的比例为1:1。但实际仪器总存在一定程度的非线性，特别是在高吸光度区域。验证光度线性通常使用一系列不同浓度的标准溶液，测量其吸光度并作图，线性相关系数应在0.999以上。

杂散光测试

杂散光是指不应该到达检测器的其他波长的光，它是影响分光光度计性能的重要因素，特别是在紫外区和测量高吸光度样品时。杂散光会使测得的吸光度低于真实值，导致在高吸光度区域出现非线性。

杂散光的测试使用截止滤光片，如碘化钠或碘化钾溶液。这些物质在特定波长以下几乎完全吸收光，理论吸光度应大于3。如果仪器测得的吸光度小于3，说明存在杂散光。优质仪器的杂散光水平应低于0.05%，即在220纳米处测量碘化钠溶液，透射率应小于0.05%。

杂散光的来源包括光学元件表面的散射、单色器内部的多次反射、灰尘和污染物的散射等。定期清洁光学部件、保持仪器内部清洁、及时更换老化的光学元件，都有助于降低杂散光水平。

噪声与基线稳定性

噪声是指仪器输出信号的随机波动，它限制了仪器能够检测的最小吸光度变化。噪声水平通常用峰-峰值或均方根值表示。测试方法是在不放样品的情况下，连续记录一段时间（如5分钟）的吸光度，计算其标准偏差。高质量仪器的噪声水平应低于±0.0005吸光度单位。

基线稳定性反映了仪器在较长时间内保持稳定输出的能力。测试方法是在预热后，连续记录30分钟或更长时间的基线，观察其漂移情况。基线漂移主要来自光源的不稳定、环境温度变化、电子元件老化等因素。良好的仪器在预热后，基线漂移应小于±0.001吸光度单位每小时。

中国计量科学研究院对市场上主流的紫外-可见分光光度计进行了系统评估，发现仪器的维护状况对性能有显著影响。定期进行性能验证、及时发现并解决问题的实验室，其测量数据的质量明显优于那些疏于维护的实验室。研究建议至少每季度进行一次全面的性能验证，每次使用前进行基线和波长的快速检查。

日常维护与保养

除了定期的性能验证，日常的维护保养也是保证仪器长期稳定工作的关键。使用前应预热仪器至少30分钟，使光源和电子元件达到热平衡。测量过程中要保持比色皿清洁，避免指纹和污渍。强酸强碱溶液可能腐蚀比色皿，有机溶剂可能溶解某些塑料部件，使用时要特别注意。

光学部件需要定期清洁，但要使用正确的方法。比色皿可以用稀酸或稀碱浸泡清洗，然后用纯水冲洗干净。单色器和反射镜的清洁需要专业人员操作，不当的清洁可能损坏精密的光学表面。仪器应放置在稳定的工作台上，避免震动和阳光直射。长期不用时，应关闭电源并盖上防尘罩。

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小结

光学测量技术是现代生物技术实验室不可或缺的分析手段。通过本章的学习，我们系统了解了光的基本性质、电磁波谱的组成、光与物质相互作用的机制，以及分光光度计的设计原理和性能验证方法。这些知识为我们正确使用光学仪器、准确解释测量结果奠定了坚实的理论基础。

朗伯-比尔定律是定量光度分析的核心，它揭示了吸光度与浓度之间的线性关系。理解这一定律的适用条件和局限性，对于设计合理的实验方案、选择适当的浓度范围至关重要。分光光度计虽然结构复杂，但其基本原理并不难理解，掌握各个组件的功能和相互关系，有助于我们在遇到问题时进行有效的故障排查。

性能验证和日常维护是确保测量数据质量的重要保障。一台保养良好、性能稳定的仪器，是获得可靠实验结果的前提。养成定期检查、规范操作、及时维护的良好习惯，不仅能延长仪器使用寿命，更能提高实验工作的效率和数据的可信度。