生物大分子溶液

在生物技术实验室中，蛋白质和核酸是两类极为重要的生物大分子。它们不仅构成了细胞的结构和功能基础，也是生命信息传递与生物化学反应的核心执行者。例如，蛋白质通过多样的结构承担着催化、生物信号传递、分子运输以及免疫响应等多种生命功能，而核酸则负责遗传信息的存储、复制及表达调控。随着现代分子生物学和生物工程学的不断发展，蛋白质和核酸已经成为医学诊断、药物研发、基因编辑、疫苗制备等诸多前沿领域研究与应用的对象。因此，理解并掌握如何正确配制、处理和储存这些大分子溶液，对于保证实验数据的准确性、实验结果的可重复性以及下游应用的可靠性具有决定性意义。不恰当的操作可能导致蛋白质变性、核酸降解，从而影响实验结论甚至科研项目的成败。

本内容将围绕蛋白质和核酸溶液的基本理化特性进行讲解，包括其溶解性、稳定性、浓度测定等内容，并详细介绍各类型溶液的制备步骤、常见试剂的选择原则，以及防止降解和变性的储存方法。通过对规范操作流程的剖析，帮助读者掌握大分子实验环节中的注意事项和实际操作技巧，为后续的实验研究和成果转化奠定坚实基础。

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蛋白质的结构与功能

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子，承担着生命体内几乎所有的功能性工作。从催化生化反应的酶，到构成细胞骨架的结构蛋白，再到调节基因表达的转录因子，蛋白质的功能多样性源于其复杂而精密的结构层次。

蛋白质的结构层次

蛋白质的结构可以分为四个层次，每个层次都对蛋白质的最终功能产生重要影响。一级结构是氨基酸的线性排列顺序，这个序列由基因编码决定。以中国科学家在2003年完成的水稻基因组测序为例，科学家们通过解读基因序列，进而推导出水稻中数万种蛋白质的一级结构，为培育高产优质的水稻品种提供了分子基础。

二级结构是指局部区域的氨基酸链通过氢键形成的规则构象，最常见的是α螺旋和β折叠。这些结构就像建筑中的砖块和钢梁，为蛋白质提供了基本的结构单元。三级结构则是整条多肽链在三维空间中的折叠方式，由多种化学键和相互作用力维持，包括氢键、离子键、疏水作用和二硫键。某些蛋白质还具有四级结构，即多条多肽链组装成的复合体，例如血红蛋白就是由四条多肽链组成的。

蛋白质的功能多样性

蛋白质的功能与其结构密切相关。酶作为生物催化剂，能够将化学反应速率提高数百万倍，这种催化能力来源于其活性位点的精确三维结构。例如，消化道中的胃蛋白酶能在酸性环境下分解食物蛋白，而胰蛋白酶则在小肠的碱性环境中发挥作用。这种环境适应性反映了蛋白质结构对功能的决定作用。

结构蛋白为细胞和组织提供机械支撑。胶原蛋白是人体含量最丰富的蛋白质，占总蛋白质的25%至35%，其三股螺旋结构赋予了皮肤、骨骼和肌腱优异的抗拉伸强度。运输蛋白负责物质的转运，血红蛋白携带氧气从肺部运送到全身组织，而白蛋白则在血液中运输脂肪酸和激素。

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蛋白质溶液的组分

配制蛋白质溶液时，需要仔细考虑多种组分，以确保蛋白质维持其天然构象和生物活性。蛋白质溶液的基本组分包括缓冲系统、盐离子、稳定剂和保护剂。

缓冲系统的选择

缓冲液是蛋白质溶液的基础，其主要作用是维持溶液pH的稳定。不同蛋白质对pH的敏感性各不相同，大多数蛋白质在pH 6至8的范围内较为稳定。常用的缓冲系统包括磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris缓冲液和HEPES缓冲液。

磷酸盐缓冲液在生理pH范围（pH 7.2至7.4）具有良好的缓冲能力，且对大多数蛋白质无害，因此被广泛应用于蛋白质纯化和储存。以中国疾控中心在疫苗生产中的应用为例，许多疫苗抗原都是在磷酸盐缓冲液中配制和保存的。Tris缓冲液的优点是缓冲范围较宽（pH 7至9），但其缓冲能力受温度影响较大，温度每升高1℃，pH值下降约0.03个单位。

盐离子的作用

盐离子浓度对蛋白质的溶解度和稳定性有显著影响。适当的离子强度可以屏蔽蛋白质表面的电荷，减少分子间的静电排斥或吸引，从而防止聚集。生理盐水含有150 mmol/L的氯化钠，这个浓度接近人体体液的离子强度，适合大多数哺乳动物来源的蛋白质。

低离子强度可能导致某些蛋白质因静电排斥而难以维持正确构象，而过高的离子强度则可能引起“盐析”现象，使蛋白质从溶液中沉淀出来。在实际应用中，通常将氯化钠浓度控制在50至200 mmol/L之间。二价阳离子如镁离子和钙离子对某些酶的活性至关重要，例如DNA聚合酶需要镁离子作为辅助因子才能发挥催化功能。

蛋白质稳定剂

为了防止蛋白质在储存和使用过程中失活，常需要添加各种稳定剂。甘油是最常用的蛋白质保护剂之一，通常以10%至50%的浓度添加。甘油能够降低水的化学活性，减缓蛋白质的水解和氧化，同时在冷冻时作为抗冻剂，防止冰晶形成对蛋白质结构的破坏。

牛血清白蛋白（BSA）常被添加到稀蛋白质溶液中，浓度通常为0.1%至1%。BSA起到“载体蛋白”的作用，可以防止目标蛋白因浓度过低而吸附到容器壁上造成损失。在中国的生物制药企业中，生产单克隆抗体时通常会在配方中加入少量人血清白蛋白，以提高抗体的稳定性和货架期。

二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇等还原剂用于保护蛋白质中的半胱氨酸残基不被氧化。蛋白酶抑制剂则是防止蛋白质被降解的关键添加物，特别是在从细胞或组织中提取蛋白质时，必须加入蛋白酶抑制剂混合物来阻止内源性蛋白酶的活性。

上图展示了蛋白质在4℃条件下储存时活性随时间的变化。可以看到，添加甘油等保护剂后，蛋白质的活性保持率显著提高，储存30天后仍能保持近80%的活性，而未添加保护剂的蛋白质活性下降到45%。

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蛋白质的储存与处理

正确的储存和处理方法是保持蛋白质活性和稳定性的关键。蛋白质是敏感的生物大分子，容易受到温度、pH、机械应力和化学物质的影响而变性或降解。

温度控制策略

温度是影响蛋白质稳定性的最重要因素之一。短期储存（数天至数周）时，大多数纯化的蛋白质可以保存在4℃冰箱中。这个温度足够低，可以显著减缓化学反应和酶促反应的速度，但又不会引起冰冻。对于特别稳定的蛋白质，例如某些工业用酶，甚至可以在室温下短期保存。

长期储存（数月至数年）则需要将蛋白质保存在-20℃或-80℃。在冷冻储存时，需要注意避免反复冻融循环。每次冻融都会导致部分蛋白质变性，因为冰晶的形成和融化会对蛋白质结构造成机械损伤，同时冻融过程中局部浓度的改变也可能引起蛋白质聚集。实践中的解决方案是将蛋白质溶液分装成小份，每次只解冻需要使用的量。

冷冻保护剂的应用

冷冻保护剂能够降低冰点，减少冰晶的形成，从而保护蛋白质在冷冻过程中不受损伤。甘油是最常用的冷冻保护剂，通常以10%至50%的浓度使用。甘油不仅能降低冰点，还能提高溶液的粘度，限制蛋白质分子的运动，减少聚集的机会。

海藻糖是另一种优秀的冷冻保护剂，在自然界中许多能够耐受极端环境的生物体内都含有高浓度的海藻糖。研究发现，海藻糖能够在蛋白质表面形成一层玻璃态的保护层，在失水或冷冻条件下维持蛋白质的结构。中国一些生物技术公司在生产冻干疫苗时，会在配方中添加海藻糖来提高疫苗的稳定性。

聚乙二醇（PEG）也常被用作蛋白质的稳定剂和冷冻保护剂。PEG是一种亲水性聚合物，能够排除蛋白质周围的水分，形成一个"排阻效应"，使蛋白质保持紧密折叠的状态。在蛋白质结晶实验中，PEG是最常用的沉淀剂之一。

机械应力的避免

蛋白质溶液在处理过程中应该尽量避免剧烈振荡、涡旋和气泡的产生。这些机械应力会在液体表面产生强大的剪切力，导致蛋白质变性和聚集。混合蛋白质溶液时，应该采用轻柔的上下颠倒或缓慢旋转的方式，而不是剧烈摇晃。

在使用移液器吸取蛋白质溶液时，吸液和排液的速度都不宜过快。快速吸液会产生气泡，而快速排液则会产生飞溅。有经验的实验人员会将移液器设置在较慢的速度档位，或者在操作时故意放慢速度。离心蛋白质溶液时，也要注意选择适当的离心力和时间，避免因过度离心而使蛋白质沉淀或变性。

上图显示了不同处理方式对蛋白质活性的影响。可以明显看出，越是剧烈的机械操作，蛋白质的活性损失越大。反复冻融5次后，仅有约20%的蛋白质保持活性。

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核酸的结构与功能

核酸是生命遗传信息的载体，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。DNA存储着生物体的遗传蓝图，而RNA则参与遗传信息的表达，包括转录、翻译和基因表达调控等多个环节。

DNA的双螺旋结构

DNA的双螺旋结构是20世纪最伟大的科学发现之一。两条互补的多核苷酸链通过碱基配对（腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对）形成稳定的双螺旋结构。这种结构不仅优雅美观，更重要的是它完美地解释了遗传信息如何被复制和传递。

DNA双螺旋的直径约为2纳米，每旋转一圈（一个螺距）包含约10个碱基对，长度为3.4纳米。DNA的糖-磷酸骨架位于外侧，带负电荷，而碱基位于内侧，通过氢键形成碱基对。这种结构使得DNA在生理条件下相当稳定，能够长期保存遗传信息。人类基因组包含约30亿个碱基对，如果将其完全展开，长度可达约2米。

RNA的多样性

与DNA相比，RNA通常以单链形式存在，且使用核糖而非脱氧核糖作为糖基，尿嘧啶替代了胸腺嘧啶。RNA的功能远比DNA多样，包括信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）以及各种调控RNA如微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。

mRNA是DNA遗传信息的临时拷贝，携带着蛋白质合成的指令从细胞核运送到细胞质。在2020年新冠疫情期间，中国快速开发的mRNA疫苗技术就是利用人工合成的mRNA指导人体细胞产生病毒的刺突蛋白，从而激发免疫反应。tRNA则像一个翻译器，能够识别mRNA上的密码子，并将相应的氨基酸运送到核糖体进行蛋白质合成。

rRNA是核糖体的主要组成成分，参与蛋白质合成的催化过程。近年来研究发现，某些RNA分子还具有催化活性，被称为核酶（ribozyme），这颠覆了以往认为只有蛋白质才能作为酶的观念。

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核酸溶液的组分与储存

核酸溶液的配制和储存相比蛋白质要简单一些，因为核酸的结构相对稳定，不像蛋白质那样容易因轻微的环境变化而失活。然而，核酸也面临着降解和污染的风险，特别是RNA极易被无处不在的RNA酶降解。

核酸溶液的基本组分

纯水或低离子强度的缓冲液是DNA溶液最简单的保存介质。常用的TE缓冲液（Tris-EDTA）含有10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）和1 mmol/L EDTA，是DNA长期储存的标准溶液。Tris提供pH缓冲，维持弱碱性环境，因为DNA在pH 7至9之间最为稳定。

EDTA在核酸溶液中扮演着关键角色。EDTA是一种强力的金属离子螯合剂，能够结合镁离子、钙离子等二价阳离子。大多数核酸酶需要金属离子作为辅助因子才能发挥活性，EDTA通过螯合这些金属离子，有效抑制了核酸酶的活性，从而保护DNA和RNA免受降解。在提取基因组DNA时，中国的生物技术实验室通常会在裂解缓冲液中加入至少10 mmol/L的EDTA。

对于RNA溶液，需要采取更加严格的防护措施。除了使用EDTA，还常常使用专门的RNA酶抑制剂，这是一种能够直接结合并抑制RNA酶活性的蛋白质。RNA溶液的pH通常保持在6至7，因为RNA在碱性条件下会发生水解。

核酸浓度的测定

核酸在紫外光下具有特征性吸收，吸收峰位于260纳米波长。这是因为核酸中的嘌呤和嘧啶碱基对这个波长的光有强烈吸收。利用这一特性，可以通过分光光度法快速测定核酸浓度。纯DNA溶液在260纳米处的吸光度为1.0时，对应的浓度约为50 μg/mL；而纯RNA在相同吸光度下的浓度约为40 μg/mL。

评估核酸纯度的重要指标是260纳米与280纳米吸光度的比值（A260/A280）。蛋白质在280纳米处有吸收峰，因此如果样品中含有蛋白质污染，这个比值就会降低。纯DNA的A260/A280比值约为1.8，纯RNA约为2.0。如果比值显著低于这些标准值，说明样品中存在蛋白质或酚类物质的污染，需要进一步纯化。

上图展示了DNA浓度与260纳米吸光度之间的线性关系。在吸光度为1.0时，对应的DNA浓度约为50 μg/mL，这是实验室中常用的参考点。这种线性关系使得分光光度法成为测定核酸浓度最简便快速的方法。

核酸的储存条件

DNA相对稳定，可以在4℃条件下保存数月至数年而不发生明显降解。对于长期储存，特别是珍贵的样品，建议保存在-20℃或-80℃。与蛋白质不同，DNA可以耐受多次冻融循环而不会显著损失质量，不过频繁的冻融仍会导致DNA片段化，特别是对于高分子量的基因组DNA。

RNA的储存要求则严格得多。RNA必须保存在-80℃，且应尽量避免冻融。许多实验室采用的做法是将RNA溶液分装成极小的份额（如5至10 μL），每次使用时取一份，用完即弃，避免反复冻融。在中国的临床检测实验室，采集的血液样品如果需要进行RNA分析，通常会在采样后立即处理，或者使用专门的RNA保护试剂稳定RNA。

近年来发展起来的RNA干燥保存技术为RNA的长期保存提供了新的解决方案。将RNA溶液冻干后，在室温下可以稳定保存数年。这种技术在疫苗运输和保存中具有重要应用价值，因为它消除了对冷链的依赖。

核酸降解的预防

防止核酸降解是保证实验成功的关键。DNA的主要威胁来自DNA酶（DNase），这类酶广泛存在于生物组织和微生物中。在提取DNA时，通常会在裂解步骤中加入蛋白酶K来消化蛋白质（包括DNA酶），并通过酚-氯仿抽提或硅胶柱吸附等方法去除蛋白质污染。

RNA的降解问题更为严重，因为RNA酶无处不在且极其稳定。RNA酶不需要辅助因子，即使在高温和极端pH条件下仍能保持活性。因此，RNA实验需要一套完全独立的器材和试剂。所有玻璃器皿应该经过高温烘烤（180℃，4小时）以破坏RNA酶活性。塑料器具应使用经过认证的无RNA酶产品。

实验室中常用DEPC处理水和溶液以灭活RNA酶。DEPC是一种强烷基化剂，能够修饰RNA酶的组氨酸残基使其失活。处理方法是在水中加入0.1% DEPC，室温过夜后高压灭菌去除残留的DEPC。不过需要注意的是，DEPC不能用于含有Tris的缓冲液，因为它会与Tris反应。

上图比较了DNA和RNA在不同温度下的储存稳定性。DNA在-20℃可以长期保存，3年后仍能保持90%以上的完整性。RNA在-80℃储存时降解速度较快，3年后完整性降至约55%。如果RNA保存在-20℃，降解将非常迅速，半年内就会损失大部分完整性。这充分说明了为什么RNA必须保存在-80℃的重要性。

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实验室实践要点

在实际操作中，配制和处理生物大分子溶液需要综合考虑多个因素。实验前应该仔细规划，选择合适的缓冲系统、pH值、离子强度和添加剂，并准备好所有必需的器材和试剂。

溶液配制的标准流程

配制蛋白质溶液时，首先要选择合适的缓冲液。根据蛋白质的等电点和实验目的，确定合适的pH值。等电点是蛋白质净电荷为零的pH值，在这个pH下蛋白质溶解度最低，容易沉淀。因此，工作pH应该远离蛋白质的等电点，一般相差2个pH单位以上。

称量蛋白质粉末时应该在冰浴上进行，因为许多纯化的蛋白质在室温下可能会部分变性。加入缓冲液后，应该轻柔地混匀，可以使用磁力搅拌器低速搅拌，或者将容器缓慢倾斜翻转。避免剧烈震荡和产生气泡。如果蛋白质不易溶解，可以在4℃冰箱中缓慢溶解过夜，而不是通过加热或剧烈搅拌来加速溶解。

溶解后的蛋白质溶液通常需要进行离心或过滤来去除不溶物。离心的条件通常是10000至15000 g，离心10至15分钟。取上清液时，移液器吸头不要触及底部的沉淀。如果使用过滤方式，应选择低蛋白结合的滤膜，孔径通常为0.22 μm或0.45 μm。

质量控制与检验

配制完成的蛋白质溶液应该进行质量检验。最基本的检验是测定蛋白质浓度，常用的方法包括考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。考马斯亮蓝法是基于考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后吸收峰的变化，操作简便快速，但会受到去污剂和某些缓冲液的干扰。BCA法是基于蛋白质在碱性条件下将二价铜离子（Cu²⁺）还原为一价铜离子（Cu⁺），再与BCA试剂显色，这种方法兼容性更好，但需要加热反应。

对于重要的蛋白质样品，还应该进行活性检测和纯度分析。活性检测根据蛋白质的具体功能设计，例如酶活性可以通过测定其催化反应的速率来评估。纯度分析最常用的方法是SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），通过这种方法可以看到蛋白质样品中各个组分的分子量和相对含量。

核酸溶液的质量控制主要包括浓度测定、纯度评估和完整性检查。除了前面提到的紫外吸收法，还可以使用荧光染料法测定核酸浓度。这种方法使用能与DNA或RNA特异性结合的荧光染料，灵敏度比紫外吸收法高得多，适合测定微量样品。完整性检查通常通过琼脂糖凝胶电泳进行，完整的基因组DNA应该显示为高分子量的单一条带，而降解的DNA会显示为弥散的拖尾条带。

记录与追溯

良好的实验室习惯要求对每一份配制的溶液进行详细记录。记录内容应该包括配制日期、配制人、各组分的来源和批号、最终浓度、pH值、储存条件以及任何相关的质量检验结果。溶液容器上应该清楚标注溶液名称、浓度、配制日期和有效期。

对于重要的生物大分子样品，建议建立完整的样品管理系统。每个样品分配一个唯一的编号，记录其来源、纯化过程、分装信息和使用记录。这种追溯系统不仅有助于实验室管理，在出现问题时也能够快速定位原因。